[发明专利]一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法

权利要求书

1.一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法，其特征在于：包括以下步骤：

a. 微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取：将50-100μL预处理的待测样品置于离心管中，向待测样品中加入25μL 2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和25μL4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，涡旋10秒后，将100-200 μL d₀-MCR6G乙腈溶液加入待测样品中，摇匀后密封并在微波反应器中反应7-8分钟，得d₀-MCR6G标记的待测样品；将50-100μL标准品混合溶液置于离心管中，向标准品混合溶液中加入25μL 2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液和25μL4-二甲氨基吡啶乙腈溶液，涡旋10秒后，将100-200 μL d₃-MCR6G乙腈溶液快速注入标准品混合溶液中，摇匀后密封并在微波反应器中反应7-8分钟，得d₃-MCR6G标记的标准品混合溶液；将d₀-MCR6G标记的待测样品和d₃-MCR6G标记的标准品混合溶液按体积比1:1混合，摇匀得混合溶液，将5-6 mg吸附剂分散到混合溶液中，溶液pH调至6-7, 振荡4分钟；磁性分离，用解吸剂将吸附的目标物从吸附剂上解吸下来，磁性分离，氮气吹干，残余物用200-300μL甲醇重新溶解，得到含羟基的胆固醇及代谢物的同位素标记衍生物萃取溶液；

所述d₀-MCR6G为；

所述d₃-MCR6G为；

所述2-氯-1-甲基碘代吡啶乙腈溶液的浓度为5-7.5 wt%；所述4-二甲氨基吡啶乙腈溶液的浓度为10-15 wt%；所述d₀-MCR6G乙腈溶液和d₃-MCR6G乙腈溶液的浓度均为1.0×10^-3 mol/L；所述微波反应器的功率为650-800 W，在微波反应器中反应的温度为45-55℃；所述标准品混合溶液的浓度介于2-3000pg/mL；

b. 将含羟基的胆固醇及代谢物的同位素标记衍生物萃取溶液经滤膜过滤，利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测；

所述d₀-MCR6G或d₃-MCR6G采用以下方法制备而成：将1g罗丹明6G溶于30 mLDMF中，室温下搅拌5分钟后，缓慢加入0.217 g NaH，反应3分钟，然后在3-5分钟内分两批加入330μLCH₃I或CD₃I，室温反应150分钟后，加入150 mL水；用150 mL氯仿萃取混合物两次，合并有机层并减压蒸馏得粗产物，经体积比1：1的甲醇/氯仿重结晶，得到紫红色固体d₀-MCR6G或d₃-MCR6G；

所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱：2.1 mm × 50 mm，1.8 µm，进样体积为2 µL，柱温30℃，采用梯度洗脱法；

所述梯度洗脱法，时间为6.8 min，流速为0.2 mL/min，流动相A为10%甲醇水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为含有0.1%甲酸的甲醇，0 min流动相组成为75% A+25% B，5 min时15%A+85% B，5.5 min时2% A+98% B，6.8 min时2% A+98% B；

所述超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中质谱的条件为：干燥气温度310℃，流速12 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度300℃，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV；

所述吸附剂为Fe₃O₄/GO；所述解吸剂为含1% 甲酸的甲醇、乙腈、乙醇或丙酮；

所述含羟基的胆固醇及代谢物为：胆固醇、24-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、27-羟基胆固醇、7α-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、7-脱氢胆固醇、维生素D₃和25-羟基维生素D₃。