[发明专利]一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法

说明书

本发明涉及分析化学领域,具体涉及一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法。该检测分析方法具体为：所述含羟基的胆固醇及代谢物与衍生试剂d₀‑/d₃‑3‑N‑甲基‑2’‑羧基罗丹明6G发生稳定同位素标记衍生反应，磁分散固相萃取后得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱分析系统进行检测。本发明利用带有永久正电荷d₀‑/d₃‑MCR6G的稳定同位素标记衍生试剂对生物样品中含羟基的胆固醇及代谢物进行标记，衍生化反应条件温和、快速，衍生化效率高，利用磁分散固相萃取技术提高了萃取效率、减少了样品前处理时间，能够显著提高分析物的色谱分离度和质谱离子化效率，并降低基质干扰。

技术领域

本发明涉及分析化学领域, 具体涉及一种含羟基的胆固醇及其代谢物的检测分析方法，尤其是涉及一种利用d₀-/d₃-3-N-甲基-2’-羧基罗丹明6G（d₀-/d₃-MCR6G）作为衍生试剂，微波辅助-稳定同位素标记衍生-磁分散固相萃取联合超高效液相色谱三重四极杆串联质谱检测的分析方法。

背景技术

含羟基的胆固醇及其代谢物是一类含有游离羟基且浓度较低的生物有机分子，存在于生物样品中，如血浆、脑脊液、肝组织、尿液和粪便等。这些化合物在大量生物体中都扮演着细胞膜的信号传导、调节和新陈代谢的重要角色。近期研究表明，含羟基的胆固醇及代谢物的浓度水平与神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化有紧密关系。

多种分析方法已被开发用于生物样品中含羟基的胆固醇及代谢物的分析，包括免疫分析、薄层层析、气相色谱-质谱和液相色谱-质谱等。文献《Simultaneousdetermination of oxysterols, cholesterol and 25-hydroxy-vitamin D₃ in humanplasma by LC-UV-MS》（PLoS One 2015, 10: e0123771）采用LC-UV-MS检测法对血浆样品中的羟基化合物进行分析，能够满足常规临床分析要求。文献《超高效液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中胆固醇含量》（理化检验-化学分册，2012，48(7): 831-833）和《固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定婴幼儿配方食品中维生素 D₂和 D₃》（中国卫生检验杂志，2014，24 (22): 3203-3207）使用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）对相关羟基分析物进行检测，相比而言在色谱分离度和质谱选择性、灵敏度方面有所提高。以上三类分析方法都采用同位素内标法进行定量，达到了降低基质效应的目的，但需要购买昂贵的同位素内标物。同时，上述直接检测方法存在检测灵敏度低、潜在的色谱分离干扰、质谱离子化效率低等缺点。专利（CN 105954430 A）公开了一种以硅烷化试剂（Tri-Sil）作为衍生试剂，通过液质联用对血清胆固醇氧化物进行测定的分析方法，显著提高了胆固醇氧化物的灵敏度。但因其在生物样品中浓度低，存在内源性干扰等，方法的灵敏度和准确度仍不足。文献《Quantification of oxysterols in human plasma and red blood cell s byliquid chromatography high-resolution tandem mass spectrometry》（Journal ofChromatography A, 2016, 1439: 82–88）以N，N-二甲基甘氨酸（DMG）作为衍生试剂同时利用同位素内标法进行定量，提高了分析方法的准确度、灵敏度和选择性。但是，大量生物代谢物没有同位素标准品可供购买，且通常它们价格十分昂贵。因此，合成一种含有稳定同位素标签的衍生试剂，对代谢物标准品进行衍生后的产物作为内标物成为了亟待解决的问题。