[发明专利]杨树叶绿体全基因组PCR扩增引物及其应用

说明书

本发明公开了一组从基因组总DNA中特异性地扩增获得杨树叶绿体全基因组的PCR引物。该PCR引物共有33对，其扩增片段范围为4.0 kb–8.0 kb，扩增产物可直接用于第三代Pacbio测序，且不同扩增片段之间具有100 bp–220 bp的重叠区域，获得PCR产物序列信息后，可以直接根据重叠区序列进行组装。本发明提供的用于杨树叶绿体全基因组PCR扩增引物，能够特异性地从杨树基因组总DNA中扩增得到叶绿体基因组序列，PCR产物适用于第三代高通量测序技术分析，操作简单，特异性强，可重复性高，易于组装，成本低。

技术领域

本发明属于生物技术PCR扩增引物设计领域，尤其是涉及杨树叶绿体全基因组序列PCR扩增的特异性引物。

背景技术

由于杨属种间易于杂交，发生基因渗入，使杨属呈现为复杂的网络状进化特征。虽然形态特征的差异是经典分类学中划分植物不同种类的重要依据，但形态特征受环境条件影响明显，具有较强的可塑性，依靠形态特征进行杨树种的识别与分类，容易产生混乱，甚至部分形态特征非常相近的杨树种无法明确其分类地位。

随着新一代测序技术的发展和系统发育基因组学的兴起，当前开发利用的植物叶绿体全基因组序列，由于具有基因组较小，并且在种间具有较高而在种内具有较小的遗传分化，提供了鉴别近缘种所需的变异位点信息，在较低分类阶元的物种系统发育学、谱系地理学和群体遗传分析中能够非常有效地提高分辨率等突出优点，近年来已被广泛应用于近缘种鉴别、系统发育学、群体遗传分析以及个体区分等方面的研究。如香脂杨与毛果杨在形态上极为相似，既使分类学家也很难将二者区分开来，经常被认为是同一物种的2个不同亚种，Huang等（New Phytologist, 2014, 204: 693-703）采用叶绿体基因序列成功地鉴别了香脂杨和毛果杨，并明确了系统发育关系。

目前主要有3种方法获取植物叶绿体全基因组序列。第1种方法是采用差速离心法等，从植物总DNA中分离得到cpDNA，进一步对cpDNA进行测序与组装，得到叶绿体全基因组序列。该方法对操作要求较严格，技术难度较高，成功率较低，尚没有得到普及应用。第2种方法是通过对植物总DNA进行Illumina HiSeq高通量测序，要求数据量在8 Gb – 30 Gb左右，测序深度在10× - 30×，对测序得到的reads，参考已有近缘种的叶绿体基因组序列进行De novo组装从而获得目标植物叶绿体全基因组序列。该方法耗时较长，专业性强，成本较高，且需要参考基因组。第3种方法是设计特异性PCR引物，以植物总DNA为模板，通过PCR扩增，将扩增产物进行高通量测序及拼装，从而获得植物叶绿体全基因组序列。该方法操作技术简单，可重复性强，成本低，效率高，尤其在样本数量较大时，能够显著地提高效率和降低成本。

为降低植物叶绿体全基因组获取的技术难度和成本，Yang等（Molecular Ecology Resources, 2014, 14: 1024-1031）设计了适用于被子植物叶绿体基因组PCR扩增的9对引物。但该9对PCR引物扩增产物不能够获得完整的杨树叶绿体基因组序列，且PCR扩增产物适用于二代测序技术。

第三代测序技术具备了超长读长（8 kb – 10 kb）和不基于PCR建库，解决了二代测序技术无法解决的难题，又提高了通量，能够快速地完成基因组组装，并能够了解表观基因组、基因组变异等信息，且每个lane的数据量达16G，一次上机分析样本数量大，实现了快速与高效。

因而，为准确获得杨树叶绿体全基因组序列信息，目前杨属树种叶绿体全基因组序列的PCR扩增引物需要进一步设计，且PCR扩增产物的长度需要符合三代测序技术的要求。

发明内容