[发明专利]携带CEACAM8突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种携带CEACAM8R78A L129A突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，切除腺相关病毒基因中病毒包装识别位点内的全部基因，插入CEACAM8抗原基因，定点突变，替换CMV启动子，得到CEACAM8突变的重组腺相关病毒载体；其中，突变位点为78位和129位，分别由CGA突变为GGA，由CTT突变为GAT，所述病毒包装识别位点为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的是p5启动子、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子或beta肌动蛋白启动子。

2.一种含有权利要求1所述携带CEACAM8R78A L129A突变抗原的重组腺相关病毒载体的产品，包括重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体/颗粒感染或转染的细胞系。

3.制备权利要求1所述携带CEACAM8R78A L129A突变抗原的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：

1)改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；

2)逆转录PCR后，扩增得到CEACAM8核心致癌cDNA；

3)将步骤2)中CEACAM8cDNA进行酶切反应，之后和步骤1)产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和CEACAM8基因的重组腺相关病毒载体；

4)利用点突变PCR方法，将CEACAM8基因突变为CEACAM8R78AL129A突变抗原基因；

5)将CMV启动子用酶切连接的方法替换为p5启动子、猴空泡病毒40(SV40)早期启动子或beta肌动蛋白启动子。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中包括以下步骤：

1)从表达CEACAM8的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；

2)以所述总cDNA为模板，在引物1：

ATGGGGCCCATCTCAGCCCCTTC和引物2：

CTAGAGGCCAGGAGAACTTCCTTGTACTAAAGC的引导下进行PCR扩增，得到的CEACAM8抗原的DNA。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)的操作方法为：

使用引物3：CAGTGGATGCCAACCGTGGAATTATAGGATATGTAATATC和引物4：CAAGTCATAAAGCTAAATGATATGAGTGAAGAAGTAACTGGC进行点突变PCR，将CEACAM8基因突变为CEACAM8R78AL129A突变抗原基因。

6.一种权利要求1所述的携带CEACAM8R78A L129A突变重组腺相关病毒的病毒载体或者权利要求2所述相关的产品在制备治疗CEACAM8抗原阳性的癌症或癌前病变药物中的应用。