[发明专利]携带CEACAM8突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

说明书

本发明是一种携带CEACAM8 R78A L129A突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，本发明的AAV/CEACAM8是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入CEACAM8抗原基因得到野生型重组腺相关病毒载体，再通过点突变得到CEACAM8 R78A L129A突变的重组腺相关病毒载体。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备细胞药物，治疗表达CEACAM8基因的癌症。

【技术领域】

本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带CEACAM8突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗CEACAM8阳性的肿瘤药物中的应用。

【背景技术】

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段LTR(上游5’端片段，下游3’端片段)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子。

1984年，美国Paul L.Hermonat证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病是帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-I)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。

AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。目前AAV可分为12种血清型(AAV-1～AAV-12)。其中，2型腺相关病毒载体(AAV-2)因具有无致病性、宿主范围广、目的基因长期表达等优点而成为当前基因治疗中最有潜力的病毒载体之一。AAV-2基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)。

如何构建各种新的可用于制备治疗疾病的药物的重组腺相关病毒及其相关产品是本领域技术人员努力的方向。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是：提出一种安全性高、携带突变癌胚抗原细胞黏附分子8(CEACAM8)的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体及其构建方法与应用。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

本发明提供了一种携带CEACAM8R78A L129A突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为CEACAM8R78A L129A突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。

本发明通过将CEACAM8与CEACAM6相互作用的关键位点突变，R78A(CGA突变为GGA)和L129A(CTT突变为GAT)，使其失去与CEACAM6相互作用的致癌能力，但保留了原来的免疫源性。最后将其嵌入腺相关病毒载体中包装成可诱导树突细胞免疫反应且不具有致癌性的CEACAM8疫苗。

已知的腺相关病毒载体具有巨噬细胞病毒(CMV)启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将CEACAM8突变抗原基因插入后成功构建的质粒的启动子替换为p5启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的任意一种。