[发明专利]阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法及应用

权利要求书

1.一种阴沟肠杆菌bla_NDM-1基因敲除的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、阴沟肠杆菌质粒抗性改造

采用质粒小提取试剂盒对氨苄青霉素耐药的阴沟肠杆菌质粒提取，通过PCR扩增四环素抗性基因片段，并采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收四环素抗性基因片段的PCR产物，将纯化的PCR产物进行酶切连接反应得到酶切连接产物，并将其转化人大肠埃希菌DH5α感受态细胞后进行酶切鉴定重组质粒；

步骤二、Red重组系统依托质粒转化入阴沟肠杆菌

采用超级感受态细胞制备试剂盒制备阴沟肠杆菌感受态细胞，将步骤一得到的重组质粒转化入制备的阴沟肠杆菌感受态细胞，对细菌基因组DNA进行提取得到阳性克隆阴沟肠杆菌；

步骤三、同源重组片段的制备和纯化

先通过PCR扩增同源重组片段，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收PCR产物，并进行DNA浓缩处理；

步骤四、阴沟肠杆菌电击感受态细胞的制备及同源重组片段的电转化

步骤五、PCR鉴定阴沟肠杆菌ΔNDM-1∷Kn重组子

步骤六、卡那霉素抗性基因的去除

制备阴沟肠杆菌ΔNDM-1∷Kn感受态细胞，将pCP20质粒转化入阴沟肠杆菌ΔNDM-1∷Kn感受态细胞，过夜培养，隔天对单克隆菌落进行氯霉素和卡那霉素敏感检测，对其敏感的菌落为bla_NDM-1基因敲除的阴沟肠杆菌。

2.如权利要求1所述的一种阴沟肠杆菌bla_NDM-1基因敲除的方法，其特征在于：所述步骤一酶切连接反应为：限制性内切酶对待改造质粒和PCR产物进行酶切；采用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切DNA片段并采用T4连接酶连接酶切片段得到酶切连接产物。

3.一种如权利要求1阴沟肠杆菌bla_NDM-1基因敲除的方法敲除bla_NDM-1基因的阴沟肠杆菌的验证方法，包括：采用RNA试剂盒提取RNA；通过反转录系统对RNA进行反转录聚合酶链反应；之后对bla_NDM-1基因进行检测。

4.一种阴沟肠杆菌bla_NDM-1基因敲除的应用，其特征在于：应用阴沟肠杆菌bla_NDM-1基因敲除方法制备的敲除bla_NDM-1基因的阴沟肠杆菌在鉴定bla_NDM-1基因对菌株的耐药性和体外竞争力和生长能力的影响。