[发明专利]阴沟肠杆菌blaNDM-1基因敲除的方法及应用

说明书

本发明公开一种阴沟肠杆菌bla_NDM‑1基因敲除的方法及应用，涉及基因工程技术领域。利用Red同源重组技术成功地将阴沟肠杆菌bla_NDM‑1基因敲除，通过PCR和测序验证bla_NDM‑1基因被成功敲除仅保留了1个FRT位点，进一步通过基因表达量验证阴沟肠杆菌的bla_NDM‑1基因表达量为对照菌株的1.2倍，说明此技术可用于阴沟肠杆菌的基因敲除与整合，同时验证了bla_NDM‑1基因敲除前后菌株生长趋势与生长速度无明显差异，对体外竞争力和耐药性有一定影响；为阴沟肠杆菌中其他基因功能的研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体的涉及一种阴沟肠杆菌 bla_NDM-1基因敲除的方法及应用。

背景技术

抗菌药物的耐药史可追溯到抗菌药物的发现及使用，近几年由于抗菌药物的广泛使用导致耐药致病菌也迅速增加；碳青霉烯类抗生素因具有抗菌谱广、抗菌作用强、耐酶且稳定等优点，临床长期广泛应用于治疗产超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrum-β -lactamases,ESBLs)及高产AmpC型β-内酰胺酶的革兰阴性菌引起的严重感染，被誉为治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线(the last-resortantibiotic)；但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae，CRE) 开始出现并逐年不断增加；bla_NDM-1基因大多位于大小不一的可接合性质粒上，某些质粒具有较强的转移能力和广泛的宿主适应范围，能在肠杆菌科细菌、假单胞菌属、气单胞菌属及霍乱弧菌属等多种属细菌中存在，并能通过接合方式在菌种内或菌种间传播。正是这些因素导致NDM-1酶阳性菌株具有流行性广、耐药性强和易传播性等特点，已成为严重影响全球的公共医疗安全问题之一。

金属β-内酰胺酶(MBLs)是一类活性位点结合有金属离子且必须依赖金属离子(主要是Zn 2+)的存在而发挥催化活性的β-内酰胺酶，该酶的水解活性强但能被EDTA、2-巯基丙酸等络合剂抑制，是肠杆菌科细菌对碳青酶烯类抗生素耐药主要原因之一，该酶主要包括 IMP、VIM、GIM、SPM、SIM及新发现的NDM-1。NDM-1酶是由269 个氨基酸组成的单一晶体，蛋白分子量27.5KDa，等电点为6.9，与其他的MBLs氨基酸序列相似性较低，与最相似的VIM-1/VIM-2相比，也只有32.4％的一致性。NDM-1含有两个锌离子结合位点即Zn1、Zn2，锌离子在底物识别过程中起着重要作用，所以将锌离子定义为NDM-1 活性中心，此活性中心较大、开放、有柔性，具有静电剖面、与底物结合或释放时活性中心能重排等特点，导致NDM-1具有强耐药性 [56-57]。作为MBLs家族的新成员，NDM-1酶无疑超过了其他几种 MBLs，成为了近年来威胁最严重的MBLs。但目前国内外学者大多聚焦在NDM-1酶阳性菌株耐药机制及转播机制的研究，而对于bla_NDM-1基因是否对菌株的生长能力和竞争力等其他生物学特性有影响却尚无定论。

Red同源重组技术是由Datsenko和Wanner等基于λ噬菌体Red 重组系统建立的新型基因敲除技术，它重组效率高、所需同源臂短、不需构建打靶质粒，省去了体外DNA酶切和连接等步骤，缩短了试验时间，提高了试验效率。但Red同源重组技术最初是用于大肠埃希菌的基因敲除和整合，目前已将其用于肺炎克雷伯菌、痢疾杆菌和沙门氏菌等细菌的基因敲除，但阴沟肠杆菌未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种阴沟肠杆菌 bla_NDM-1基因敲除的方法，用于敲除阴沟肠杆菌质粒上的bla_NDM-1的耐药基因，从而验证bla_NDM-1基因对阴沟肠杆菌的耐药性、生长能力和体位竞争力的影响。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：