[发明专利]一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，通过抽取外周静脉血，分离并提取单个核细胞，并诱导其分化为早期内皮祖细胞，且培养过程中严格控制技术参数。本发明方法简单易行，安全性高，且早期内皮祖细胞的得率高(98.8％)，适合大规模的推广应用。

技术领域

本发明涉及一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，属于生物技术领域。

背景技术

内皮祖细胞(EPCs)有两种亚型，分别为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞，其两种亚型在细胞来源、细胞形态、细胞表面标志、细胞增殖能力、分化能力和功能方面存在差异。其共同存在的问题是内皮祖细胞的来源比较困难，或者获取细胞的风险较大。目前比较常见的是培养晚期内皮祖细胞。虽然晚期内皮祖细胞在形成内皮细胞和修复损伤内皮的功能较好，但是由于其抗氧化能力和抗炎能力均弱于早期内皮祖细胞，在进行自体回输治疗血栓栓塞性疾病时，由于机体普遍存在脂质过氧化和炎症的情况下，会影响晚期内皮祖细胞在体内的存活时间及功能。早期EPCs可通过分泌各种细胞因子促进损伤的血管内皮和缺血组织的内皮修复和血管生长、增强晚期EPCs的成血管作用，从而参与血管的新生。因此，有必要研究一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，为早期内皮祖细胞的推广应用奠定基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，包括以下步骤：

S1：将磷酸盐缓冲液和外周静脉血混匀，得到稀释的血液；

S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，不要混匀；

S3：以400～500g离心40～50分钟，温度控制在18℃～20℃；

S4：除去血浆部分，取出单个核细胞层，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液混匀；

S5：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；

S6：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，即得单个核细胞；

S7：将获得的单个核细胞用EBM完全培养基重悬，调整细胞密度后，放置于人纤维黏连蛋白包被的细胞培养瓶，放入培养箱中；培养至4～5天，即得早期内皮祖细胞。

优选的，步骤S1中，磷酸盐缓冲液和外周静脉血的体积比为1:1。

优选的，步骤S2中，稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为4：3。

优选的，步骤S4中，单个核细胞层与磷酸盐缓冲液的体积比为1：3。

优选的，步骤S7中，调整后细胞密度为1×10⁷个/mL。

优选的，步骤S7中，在培养箱内培养的条件为：培养的24h内，保持氧浓度为3％，培养的第2～3天，保持氧浓度为10％，培养至第4天，保持与室内氧浓度相同。

优选的，步骤S7中，在培养箱内培养的条件为：培养的24h内，保持二氧化碳浓度为3.5％，培养的第2～3天，保持二氧化碳浓度为4.5％，培养至第4天，保持与室内二氧化碳浓度相同。

优选的，步骤S7中，在培养的第2～3天，加入黄芪提取物和山苦茶提取物。

优选的，黄芪提取物的浓度为1.2μg/mL，山苦茶提取物的浓度为1.0μg/mL。

优选的，黄芪提取物的活性成分为黄芪多糖，山苦茶提取物的活性成分为山苦茶多糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：