[发明专利]提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，其特征在于，所述质粒pCDSP包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；

质粒pCDSP的制备方法具体按照以下步骤实施：

步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；

步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证；

在所述步骤1中，Scp-2蛋白基因scp2的两端分别添加有NcoI酶切位点和EcoRI酶切位点；

在所述步骤2中，先采用NcoI和 EcoRI两种限制性内切酶分别对质粒pUCSP与载体pCDFDuet-1进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收Scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pCDFDuet-1，之后再通过连接反应将Scp-2蛋白基因片段插入线性化的载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中，最后利用氨苄青霉素抗性基因筛选得到质粒pCDSP；

所述利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，先将野生菌株E. coli C43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得能够合成角鲨烯的重组菌E. coli CSQ1，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列4所示；

步骤2，热击法将质粒pCDSP转入E. coli CSQ1，利用链霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E. coli CSSP1；

步骤3，分析重组菌E. coli CSSP1中角鲨烯的含量；具体为：先采用LB液体培养基培养重组菌E. coli CSSP1，之后加入诱导剂IPTG诱导Scp-2蛋白基因scp2表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。