[发明专利]提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用方法

说明书

本发明公开了一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet‑1，载体pCDFDuet‑1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp‑2蛋白基因scp2，Scp‑2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp‑2蛋白基因scp2的表达。本发明开还公开了该质粒pCDSP的制备和使用方法。本发明提供的质粒pCDSP为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的方法与工具。

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，还涉及一种该质粒pCDSP的制备方法，还涉及一种该质粒pCDSP的使用方法。

背景技术

角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。

微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，用于提高大肠杆菌中角鲨烯的合成。

本发明的第二个目的是提供一种上述质粒pCDSP的制备方法，用于制备该质粒pCDSP。

本发明的第三个目的是提供一种利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，用以实现如何使用该质粒pCDSP促使大肠杆菌大量合成角鲨烯。

为了达到上述第一个目的，本发明所采用的第一种技术方案是，一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。

为了达到上述第二个目的，本发明所采用的第二个技术方案是，一种质粒pCDSP的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；

步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP；

步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证。

本发明的第二种技术方案，还具有以下特点：

在所述步骤1中，Scp-2蛋白基因scp2的两端分别添加有NcoI(CCATGG)酶切位点和EcoRI(GAATTC)酶切位点。

在所述步骤2中，先采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶对质粒pUCSP与载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收Scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pCDFDuet-1，之后再通过连接反应将Scp-2蛋白基因片段插入线性化的载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中，最后利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pCDSP。