[发明专利]一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法

说明书

本发明属于蛋白质纯化领域，具体涉及一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法。本发明制备分子生物级牛血清白蛋白的方法包括吸附剂分散液制备、吸附剂纯化牛血清白蛋白样品、肝素‑琼脂糖层析柱处理牛血清白蛋白样品、超滤浓缩以及透析处理等步骤。本发明的方法采用硅藻土与Heparin‑sepharose层析柱的结合对牛血清白蛋白样品进行纯化，能够去除牛血清白蛋白样品中的核酸酶，得到分子生物级的牛血清白蛋白；整个纯化过程都在低温环境下进行，最大限度的保持了牛血清白蛋白的活性；并且不涉及DEPC处理，不会对环境造成污染；可以可完全去除牛血清白蛋白中微量的核酸酶，省时省力且回收效率高，便于放大规模。

技术领域

本发明属于蛋白质纯化领域，具体涉及一种制备分子生物级牛血清白蛋白的方法。

背景技术

核酸酶是一种能催化核苷酸链(DNA和RNA)中磷酸二酯键水解的酶，作用于磷酸二酯键的P-O位置，广泛存在于动植物体内及空气中。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。只能作用于RNA的称为核糖核酸酶(RNase)，只能作用于DNA的称为脱氧核糖核酸酶(DNase)，有些核酸酶既能作用于RNA也能作用于DNA，因此统称为核酸酶(nuclease)。根据核酸酶作用位置的不同，可将核酸酶分为核酸外切酶(exonuclease)和核酸内切酶。

由于核酸酶具有很强的降解核酸(DNA及RNA)的能力，因此在以核酸为模板的检测中，由于存在核酸酶污染很容易出现假阴性结果。另外，核酸酶的耐热性较好，尤其是RNase酶，即使经过高温处理也仍可能有残留的活性。通常PCR检测过程中，对所用水、液体试剂等的灭活主要采用DEPC(剧毒)水浸泡灭活处理，并且之后必须进行高温高压降解DEPC处理。牛血清白蛋白(BSA)是一种常用的PCR扩增增强剂和稳定剂，它能够起到稳定扩增酶、降低PCR抑制物的作用，减少扩增酶蛋白对容器的吸附等作用。由于BSA生物来源的属性，必然会残留一定量的核酸酶；为了避免其蛋白变性，又不能采用剧烈条件对核酸酶进行灭活处理。因此需要一种更有效的去除BSA中核酸酶的方法，以提高BSA在核酸检测，如PCR检测中的效果。

硅藻土具有密度小、比表面积大、多孔、吸附性强、耐酸、耐碱、熔点高等特点，主要性质如下：(1)硅藻土表面有大量不同种类的羟基，硅藻土中的羟基与其吸附性能直接相关，羟基越多，则吸附性能越好。硅藻土中的羟基在热处理条件下可以发生转化，改变硅藻土的吸附性能。此外，这些羟基具有活性，能与其他物质发生反应，改变硅藻土的吸附特性；(2)硅藻土表面的电荷一般为负电荷，使得硅藻土颗粒表现出一定的负电性，在大多数pH值范围内硅藻土表面都带负电，能与其他一些带正电荷的蛋白质结合，进而实现对蛋白质的纯化作用。

由于其廉价、吸附性强、化学性质稳定等特性，硅藻土已经被广泛应用许多领域。淳俊等人利用硅藻土能有效吸附RNA酶这一特性，开发了一种广泛适用的RNA提取方法。结果表明采用硅藻土-苯酚提取方法提取RNA的得率是异硫氰酸胍法的3倍多，而且使用范围较广。但是没有对提取的RNA样品中残留的核酸酶进行测试。翟玲等人报道了一种去除牛血清白蛋白蛋白中的RNA酶的方法，采用高岭土对牛血清白蛋白溶液进行吸附，通过电泳法进行检测，结果表明，37℃条件下未经高岭土处理的BSA在1个小时内没有表现出RNA酶活性，但2小时后表现出明显的RNA酶的活性，而经过高岭土处理的BSA在2小时内几乎不水解RNA，但该检验方法为电泳法，灵敏度相对较低，微量残留的核酸酶检测不到。