[发明专利]三角枫的组织培养方法

权利要求书

1.一种三角枫的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)材料：取生长健壮的四年生三角枫，且母株均为实生苗，剪取当年生半木质化且无病虫害的枝条；

(2)方法：

(2-1)外植体的采集：于3-5月份晴天的中午，采集部位为当年生枝条中上部的带腋芽茎段；

(2-2)外植体预处理：将采集好的枝条剪成带腋芽的小段，长1-2cm；先将修剪好的茎段放入高浓度洗衣粉溶液中浸泡15min，之后用自来水冲洗干净；在上一步操作完成后，再将茎段放入农药0.1％多菌灵和0.03％链霉素中浸泡10min并用流水冲洗2h；

(2-3)茎段表面消毒：将冲洗好的外植体转入超净工作台进行进一步的消毒处理；先用75％的酒精消毒30s并不断搅拌，再用无菌水冲洗2-3次；接着用0.1％的升汞浸泡4-12min，最后用无菌水冲洗5-6次；消毒处理完成后，将外植体沥干水分，并对其两端进行适当的修剪，然后形态学朝上接种在供试培养基上；

(2-4)茎段处理，选择L₉(3⁴)的正交设计，设置3个因素，每个因素3个水平；分别为培养基MS，NN69，WPM，6-BA设置0、0.5、1.0mg·L^-1三个浓度，NAA设置0、0.1、0.3mg·L^-1三个浓度，共9个处理，重复三次；每种处理均加入7.1g·L^-1琼脂，30g·L^-1蔗糖，并将pH控制在5.8；

(2-5)启动培养：将经过消毒灭菌的外植体两端切口处稍做修剪，修剪成1-1.5cm的单芽茎段，直立式接种于启动培养基上，茎段萌芽生长的启动培养基为NN69+6-BA0.5mg·L^-1+NAA0.3mg·L^-1 +琼脂7.1g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，诱导率为71.7％；

(2-6)初代培养环境：将已接种好的三角枫茎段放置在无菌培养室中培养，控制室内温度22-25℃；光照周期为12h光照，12h黑暗；光照强度为2000lx；此外，每周用75％的酒精给培养室与培养架消毒；

(2-7)增殖培养：将经过启动培养25d的组培苗，截取成1.5cm的单芽茎段，剪去下部较大的能接触到培养基的叶片，垂直接种于增殖培养基中；增殖培养基配方为：MS+BA0.3mg·L^-1+NAA0.01mg·L^-1 +GA0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.5g·L^-1，pH值调整为5.8，增殖系数达4.0，且组培苗生长健壮，节间明显伸长；

(2-8 )生根培养：增殖培养20d后，选取健壮的组培苗，将基部进行适当修剪，转入生根培养基进行根的诱导；生根培养基为：1/2MS+NAA1.0mg·L^-1 +蔗糖20g·L^-1 +琼脂7.0g·L^-1，pH值调至5.8，生根率达90％。