[发明专利]分泌鼠毒素的鼠疫菌质粒缺失突变株在制备天然鼠毒素中的应用

说明书

本发明提供了一种分泌鼠毒素的鼠疫菌质粒缺失突变株在制备天然鼠毒素中的应用、以及制备天然鼠毒素的方法。该提取鼠毒素的方法是将含有pMT1质粒且缺失了pPCP1质粒的鼠疫菌置于培养基中培养，将上清沉淀后通过亲和层析的方法来提取纯化天然鼠毒素蛋白。该提取鼠毒素的方法不仅简单、方便，而且获得的鼠毒素具有较好的生物学活性。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及分泌鼠毒素的鼠疫菌质粒缺失突变株及其在制备天然鼠毒素中的应用。

背景技术

鼠疫菌含三个毒力质粒，它们分别是pCD1、pMT1和pPCP1。其中，pCD1质粒是从假结核菌遗传来的，而pMT1和pPCP1则是鼠疫菌在进化过程中通过水平转移从外界获得的。pCD1质粒主要编码III 型分泌系统(T3SS)。T3SS是一种细菌接触依赖的、向宿主细胞内靶向转运毒力因子的转运机制(Cornelis GR,Van Gijsegem F.Assembly and function of typeIII secretory systems.Annu Rev Microbiol 2000；54: 735-774.)。通过T3SS，鼠疫菌可将其胞浆中的效应蛋白“注射”到宿主细胞内，通过干扰细胞的正常生理功能，抑制宿主细胞的免疫反应，进而建立持续感染(Brubaker RR.Interleukin-10 and inhibition ofinnate immunity to Yersiniae:roles of Yops and LcrV(V antigen).Infect Immun2003；71:3673-3681.)。pPCP1质粒主要编码血浆酶原激活因子，增强鼠疫菌的皮下侵袭能力(Lathem WW,Price PA,Miller VL,Goldman WE. A plasminogen-activating proteasespecifically controls the development of primary pneumonic plague.Science2007；315:509-513.)。pMT1质粒编码F1抗原和鼠毒素(Murine toxin,Ymt)。F1抗原是鼠疫菌重要的保护性抗原，而鼠毒素则是维持鼠疫菌能在跳蚤体内存活从而引起传播和流行的关键因素(Felek S,Muszynski A,Carlson RW,Tsang TM, Hinnebusch BJ,KrukonisES.Phosphoglucomutase of Yersinia pestis is required for autoaggregation andpolymyxin B resistance.Infect Immun 2010；78:1163-1175.)。

鼠毒素是由鼠疫菌产生的一种对小白鼠和大白鼠强毒、但对豚鼠以上大动物或人低毒的毒素。从鼠疫菌培养物种中提取纯化的鼠毒素，腹腔注射小白鼠的LD50(按每公斤体重计算)大约是10-185μg (Hinnebusch J,Cherepanov P,Du Y,Rudolph A,Dixon JD,Schwan T,et al.Murine toxin of Yersinia pestis shows phospholipase D activitybut is not required for virulence in mice.Int J Med Microbiol 2000 Oct；290(4-5):483-7.)，而静脉途径的LD50大约是10μg(Ajl SJ,Rust J,Jr., Hunter D,WoebkeJ,Bent DF.Preparation of serologically homogeneous plague murine toxin andits reactions with physical,chemical and enzymatic agents.J Immunol 1958Jun；80(6):435-40.)。