[发明专利]大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途

权利要求书

1.一种同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌E. coli W3110的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再将Ptrc启动子控制的核苷酸序列如Gene ID: 936852所示的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点，获得基因工程菌。

2.权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌用于发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：

将菌种活化后制备种子液，按10-15%接种量接种到装有发酵培养基的500 mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1 mL60%（m/v）葡萄糖溶液；发酵周期22-28 h；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖20-40 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-6 g/L，KH₂PO₄ 1-5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-2 g/L，酵母提取物1-5 g/L，柠檬酸1-4 g/L，L-苯丙氨酸0.1-0.5 g/L，L-酪氨酸0.1-0.5 g/L， FeSO₄·7H₂O 30-60 mg/L，MnSO₄·7H₂O 1-5 mg/L，V_H 0.1-0.5 mg/L，V_B10.5-1.0 mg/L，微量元素混合液1-3 ml/L，苯酚红15-30 g/L，余量为水，pH 7.0-7.2，115℃ 高压蒸汽锅灭菌15 min；所述微量元素混合液组分为：Na₂MoO₄·2H₂O 2.5 g/L，AlCl₃·6H₂O 2.5 g/L，NiSO₄·6H₂O 2.5g/L，CoCl₂·6H₂O 1.75 g/L，CaCl₂·2 H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5 g/L，CuCl₂·2 H₂O 0.25 g/L，H₃BO₃ 0.125g/L。

4.一种同步高产L-色氨酸与L-缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，步骤如下

（1）采用大肠杆菌CRISPR/Cas基因编辑技术，以E. coli W3110为出发菌株，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)基因，所述trpE(S40F)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；

（2）将Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点，所述aroG(S180F)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；

（3）将Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点，所述serA(H344A,N364A)基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；

（4）将Plac启动子控制的嗜酸乳杆菌glnA基因整合至ycjV假基因位点，所述glnA基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；

（5）将Ptrc启动子控制的核苷酸序列如Gene ID: 936852所示的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点，获得基因工程菌。