[发明专利]大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途

说明书

本发明提供一种同步高产L‑色氨酸与L‑缬氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其用途。所述基因工程菌是在大肠杆菌的基因组上，将色氨酸操纵子的启动子替换为Ptrc启动子的同时引入trpE(S40F)突变；将由Ptrc启动子控制的aroG(S180F)基因整合至tyrR位点；将由Plac启动子控制的serA(H344A,N364A)基因整合至yjiV假基因位点；将由Plac启动子控制的glnA基因整合至ycjV假基因位点；再将Ptrc启动子控制的枯草芽孢杆菌alsS基因整合至yghx假基因位点获得。利用该菌株进行摇瓶发酵可在22‑28h内积累L‑色氨酸达10‑14g/L，同时缬氨酸积累量达5‑7g/L，总产酸能力比色氨酸生产菌株提高了50％左右，同时菌体OD₆₀₀相差不大，不存在生长问题，但单位菌体产酸能力明显提高了120％，大大提高了碳源和细胞的有效利用。

技术领域

本发明涉及一株大肠杆菌基因工程菌以及利用其发酵同步生产L-色氨酸与L-缬氨酸的用途，属于微生物代谢调控和基因工程技术领域。

背景技术

L-色氨酸与L-缬氨酸，同属于八种必需氨基酸，因其营养价值，已被广泛用于饲料、食品和药品等领域。色氨酸与缬氨酸的生产方法包括化学合成法、酶反应法、发酵法等，但随着基因工程手段的逐渐完善，利用微生物直接发酵法来生产色氨酸或缬氨酸得到迅速发展，该方法以葡萄糖等低价原料为碳源经微生物发酵生产得到目的产物，生产成本较低，生产工艺相对简单可控。

最初诱变育种是氨基酸生产菌株获得的常规手段，随着基因组测序技术的兴起，人们将获得的生产菌株进行测序，得到氨基酸合成途径中已解除反馈抑制的关键酶的基因序列，这为后续代谢工程手段改造大肠杆菌生产氨基酸提供了基础。L-色氨酸的合成代谢途径长而复杂，涉及的前体物较多，很难在野生菌株中积累，色氨酸合成途径涉及到糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)和磷酸戊糖途径(HMP)，经代谢工程手段强化色氨酸合成途径仅是大肠杆菌生产L-色氨酸生产菌株构建的基础，寻找并实现EMP、TCA和HMP途径之间的动态平衡才可避免因能量失衡带来的各种问题。Lin Chen和An-Ping Zeng等人(Rationaldesign and metabolic analysis of Escherichia coli for effective production ofL-tryptophan at high concentration[J].Appl Microbiol Biotechnol,2017,101(2):559-568.)以大肠杆菌W3110为出发菌株，敲除或失活了aroF、aroG、mtr、tnaA、tnaB等基因，同时将带有点突变且解除了反馈抑制的基因aroG(S180F)和serA(H344A，N364A)组成受Ptac调控的操纵子整合至基因组，最后经发酵罐测试，色氨酸可积累27g/L左右，但在发酵时间达36h后，菌体的单位耗糖及产酸能力比原来降低70％左右，文中也并未对其原因进行分析。

相较于L-色氨酸，L-缬氨酸的合成途径相对简短直接，丙酮酸为缬氨酸合成的唯一前体物，经第一个关键酶乙酰乳酸合酶(AHAS)催化，进入缬氨酸合成途径，再经三步反应便得到L-缬氨酸。以大肠杆菌为出发菌株构建L-缬氨酸生产菌株，找到高酶活的可解除缬氨酸反馈抑制的AHAS，提高中间代谢物的传递效率是关键，韩国人Sang Yup Lee等人(Fed-Batch Culture of Escherichia coli for L-Valine Production Based on In SilicoFlux Response Analysis[J].BiotechnologyBioengineering,2011,108(4):934.)通过对AHAS中的调节亚基(ilvH)引入特定的点突变，解除缬氨酸对AHAS的反馈抑制，缬氨酸产量明显提升，但是丙酮酸供应是进一步提高缬氨酸产量的瓶颈，因丙酮酸是胞内重要的中间代谢产物，其主要的代谢去向是经丙酮酸脱氢酶复合体催化为乙酰CoA，最终进入TCA循环，为细胞生长提供能量。合理分配丙酮酸的代谢流向，在提高缬氨酸产量的同时避免菌体因能量供应不足生长受阻是在构建缬氨酸生产菌株时需解决的问题。