[发明专利]梅毒螺旋体重组蛋白Tp0971的表达纯化及应用

说明书

本发明涉及重组蛋白，提供一种梅毒螺旋体重组蛋白Tp0971的表达纯化及应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；以基因组DNA为模板，以上游引物P1、下游引物P2扩增，原核质粒PET30a(+)与目的基因Tp0971双酶切和纯化，将PET30a(+)载体与Tp0971基因连接，构建重组表达质粒pET30a(﹢)‑Tp0971，将其转化到E.coli BL21中并用IPTG诱导表达出相应的重组融合蛋白，镍柱亲和纯化后获得纯化的重组蛋白，还提供了含有重组蛋白rTp0971的用于梅毒诊断和判愈的ELISA试剂盒。本发明对梅毒的诊断具有良好的特异性和灵敏性。

技术领域

本发明涉及重组蛋白，具体涉及梅毒螺旋体重组蛋白Tp0971的表达纯化及应用。

背景技术

梅毒(syphilis),是一种严重危害人类身心健康、经典而古老的性传播疾病。其临床发病隐匿、临床症状复杂而多变，早期感染极易漏诊或误诊，其病原体是苍白密螺旋体苍白亚种[Treponema pallidum subspecies pallidum]，俗称梅毒螺旋体(Tp)，主要经性接触、输血传播以及母子垂直传播等方式途径感染。有流行病学数据表明世界范围内有3600万梅毒患者，每年有大于1100万的新发病例。尽管近年来这一数据有所下降，梅毒依然是引起畸胎、流产、死胎的重要原因影响出生人口质量。此外，由于传播途径和艾滋病(AIDS)相同，梅毒大大增加了感染艾滋病的风险。我国的梅毒感染率和发病率近年来却一直呈直线上升趋势，在2010年卫生部公布的全国法定传染病报告中梅毒仅次于病毒性肝炎、肺结核位居第三位，并居于人类性传播疾病(STD)首位。如何有效控制和预防梅毒，目前已成为我国乃至全世界普遍关注的公共卫生问题。及时、准确、可靠的诊断方法特别是早期梅毒的诊断对于梅毒的管理来说尤为重要。

由于梅毒螺旋体(Tp)一直不能进行体外培养，这在很大程度上一直限制着Tp致病机制的阐明和梅毒诊断方法的发展。事实上，梅毒目前的诊断主要也是依靠血清学诊断方法，目前对于梅毒的血清学筛查实验程序主要有两类：传统的筛查程序和与之对应的逆序筛查法。美国疾病预防控制中心(CDC)建议使用传统方法:即梅毒血清学筛查，实验始于一种非梅毒螺旋体的实验：RPR、TRUST或者VDRL，进而用一种梅毒螺旋体实验予以确证。实验室协会，英国健康保护署，国际反性传播疾病联盟则鼓励采用逆序筛查程序。近年来有学者支持逆序筛查，亦有学者对逆序筛查持谨慎的态度。FTA-ABS、TPPA试验具有极高的敏感性和特异性，是目前公认的梅毒确证方法，但是价格昂贵，数据不易保存，难以自动化且不能用于疗效和再感染的判断。市售的胶体金法虽然简便快速，目前也在临床得到了应用，但存在低浓度难以检出，假阴性反应等问题。PCR检测在梅毒的检测中也得到了应用，有学者认为Tp-DNA检测在一期梅毒和二期梅毒中有很重要的意义。但PCR方法难以普及，一般只在实验室才得以实现。TRUST/RPR一般用于梅毒的疗效判断，前已述及，假阳性反应(病毒感染、自身免疫病、嗜异性抗体等因素)是其重大的缺陷，并且其不能作为梅毒的诊断试验。而以梅毒螺旋体为基础的血清学试验尤其是酶联免疫法和化学发光法检测，因其操作简便，重复性、灵敏度和特异度均较好，且易于实现自动化，大大降低了工作量，提高工作效率，受到人们的青睐。但是对于相同的标本，不同的试剂盒之间因检测的对象不同(IgG/IgM抗体)结果可能会不完全一致，此外，目前的ELISA试验还无法用于梅毒疗效的判断，为此，本课题希望从梅毒螺旋体菌体中寻找到既可以用于梅毒的诊断，又能用于梅毒疗效判断的蛋白。