[发明专利]一种DNA甲基化定量系统

说明书

本发明涉及一种DNA甲基化定量系统。该系统包括获取待测DNA样品中，甲基化和非甲基化待测CpG的量的采集构件，以及通过甲基化/(甲基化+非甲基化)×100计算甲基化百分比参数PMR的处理构件。该系统不仅适用于CpG岛内的共甲基化CpG位点的甲基化定量，还尤其适用于针对侧翼序列没有CpG位点的DNA甲基化定量。该方法不需要对照反应和完全甲基化的DNA标准品作为参照，从而可以克服它们带来的缺陷，具有更高的重复性和准确性。

技术领域

本发明属于分析方法技术领域，涉及一种DNA甲基化定量系统。

背景技术

癌症组织中存在的胞嘧啶-5DNA甲基化(m5C)被认为是具有潜在临床价值的DNA表观修饰[1]。在脊椎动物中，m5C主要出现在CpG二核苷酸。在多种肿瘤中已经证实，抑癌基因启动子的CpG岛(CGI)异常甲基化导致了转录失活[2]。启动子内的CGI仅代表甲基化的一小部分，而主要位于基因体中的CpG open sea则代表了真核生物中最保守的DNA甲基化靶标，但该区域甲基化的功能尚不清楚。最近的研究揭示了非启动子区域(如基因体和UTR)甲基化对基因表达的协同效应，基因体甲基化可能是癌症中潜在的治疗靶点[3]。此外，基因体甲基化可能是RNA选择性剪接调控的潜在机制[4]，并且可限制转录起始，从而阻止异常转录[5]。我们在以往研究中通过EPIC甲基化芯片发现，复发和非复发结直肠癌患者的差异甲基化位点(differential methylation positions,DMPs)在CGIs和启动子中很少，但在open sea和基因体中很多。我们还在基因体中发现了与基因过表达相关的一组高甲基化CpG位点。

由于分析基因组中的甲基化有很大的价值，许多检测甲基化的方法和技术得以开发。

目前，常用于队列验证的甲基化定量方法有三种。1、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)是一种终点分析技术[6,7]，使用甲基化特异性引物扩增DNA样品后，通过观测DNA凝胶电泳的条带强弱，可以对待测位点的甲基化水平进行判断，但这只能实现半定量的甲基化检测；2、之后，第二代基于PCR的技术——MethyLight(定量MSP)被用来进行定量检测[8-10]，样品的待测位点甲基化反应荧光信号值通过与AluC4反应相比进行输入控制，再与完全甲基化样品相比，得到甲基化比例[11,12]，这一定量体系的缺陷显而易见，尤其是在基因组不稳定的肿瘤标本中，全基因组拷贝数变异和突变对待测位点和AluC4内参照稳定性的影响无法完全避免，而且两个独立反应中随机误差的累积会造成检测的重复性和准确性降低。此种方法，由于甲基化水平的绝对定量依赖甲基化标准品，如果要获取某位点甲基化水平的绝对值，需同时设置100％甲基化标准品，通过样品和标准品的比值计算甲基化百分比参数(percentage of methylation ratio,PMR)。若甲基化标准品生产批次不同或存在不可避免的质量缺陷，如CG位点未100％甲基化、m5C自发脱氨基转化为T、DNA降解等，将造成甲基化水平绝对值定量的严重误差。3、在亚硫酸氢盐焦磷酸测序中，通过测序反应中在待测位点消耗的C和T碱基，或G和A碱基的数量，间接计算待测位点的甲基化比例，计算方法当测序引物在正义链时为：C峰高度/(C峰高度+T峰高度)×100；测序引物在反义链时为：G峰高度/(G峰高度+A峰高度)×100。焦磷酸测序是目前被广泛认为最为准确的一种甲基化定量技术，但该检测需要专门的焦磷酸测序仪，目前仅有少数的国内科研和商业机构提供该测序仪的开放使用或服务，并且测序成本、检测工作量和检测周期远高于基于PCR的MSP和定量MSP。

此外，现有的DNA甲基化检测技术都要求待测位点位于具有成簇CpG二核苷酸的区域，例如CpG岛，以允许设计的引物和探针覆盖足够多的CpG位点，检测的也并非是这一位点，而是被引物和探针覆盖的全部CpG位点共甲基化的状况，然而，现有技术存在以下问题：

(1)无法准确检测基因组中存在的杂合甲基化。如果相邻CG位点未表现为共甲基化现象，在此区域无法成功设计qMSP技术所需的引物和探针。