[发明专利]一种幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别公开了一种幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法。该幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法，包括如下步骤：将布氏肉汤培养基装入三角瓶，加入胎牛血清，加入平板培养的幽门螺旋杆菌的菌丝体，三元气置换下进行摇床培养；将布氏肉汤培养基加入种子罐，灭菌后加入胎牛血清，接入培养好的幽门螺旋杆菌摇瓶培养液，三元气保护下培养；将培养好的幽门螺旋杆菌种子液转入发酵罐内的布氏肉汤培养基中，加入胎牛血清通入三元气培养，得到产品。本发明步骤简单，培养基中仅使用少量胎牛血清，大大低于传统浅层培养基中10%的添加量，生产成本大幅度降低，填补了目前国内外幽门螺旋杆菌深层液体培养的技术空白。

（一）技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法。

（二）背景技术

1983年，澳大利亚学者Marshall和Warren成功地从胃炎和消化性溃疡患者的胃粘膜标本中分离出幽门螺旋杆菌。

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，简称HP），革兰氏阴性，弯曲杆菌目，螺旋杆菌科，寄生在胃粘膜上皮与粘液间，是目前发现唯一能够在胃内存活的微生物。资料研究表明，幽门螺旋杆菌感染与慢性胃炎¸消化性胃溃疡和淋巴瘤的发病密切相关，根除幽门螺旋杆菌可有效预防上述疾病。目前如何根除 HP所致的消化系统疾病已成为消化界学者关注的热点。

我国幽门螺旋杆菌感染率超过50%，儿童/青少年的感染率为25%-30%，根治幽门螺旋杆菌的方法是采用以抗生素治疗为主的三联或四联疗法。随着幽门螺旋杆菌耐药性的提高，其根除率降低；幽门螺旋杆菌感染作为一种感染性疾病，最理想的治疗策略是应用疫苗和抗体，在疫苗和抗体的研制和生产过程中需要大量的幽门螺旋杆菌菌体抗原。目前文献报道中提供的幽门螺旋杆菌培养方法一般是采用固体斜面¸固体平板或液体摇瓶培养方法，这些方法仅能提供少量的幽门螺旋杆菌菌体，不能够满足工业化幽门螺旋杆菌抗原生产的需要。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种步骤简单、生产成本低的幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种幽门螺旋杆菌的深层液体培养方法，包括如下步骤：

（1）将布氏肉汤培养基装入三角瓶，三角瓶的橡胶塞上装有带无菌过滤器的进出气管，灭菌后向三角瓶内加入胎牛血清，加入平板培养的幽门螺旋杆菌的菌丝体；

（2）通过橡胶塞上的进出气管将三角瓶内的气体用三元气置换，之后于37℃下进行摇床培养，中间换气若干次；

（3）将布氏肉汤培养基加入种子罐，灭菌后加入胎牛血清，接入培养好的幽门螺旋杆菌摇瓶培养液，37℃下于三元气保护下培养，控制溶氧大于25%；

（4）将培养好的幽门螺旋杆菌种子液转入发酵罐内的布氏肉汤培养基中，加入胎牛血清连续或间歇通入三元气使溶氧维持在25%以上，37℃下培养至耗氧量变缓，放罐，得到产品。

HP由于其特殊的生物学特性，对培养条件要求十分苛刻，空气或厌氧条件下都会对其产生抑制作用。本发明培养过程始终处于三元气体的保护下，避免了因长时间暴露于空气中而使菌种的活性受到抑制。

本发明的更优技术方案为：

步骤（1）、（3）和（4）中，胎牛血清于56℃下保温0.5h进行补体去除，之后再使用。

步骤（2）、（3）和（4）中，三元气为体积比为5:15:80的氧气、二氧化碳和氮气的混合气体。

步骤（1）中，胎牛血清的添加量为布氏肉汤培养基质量的8-12%，幽门杆菌的接种量为1-2个平板/200mL培养液。