[发明专利]一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法及应用

权利要求书

1.一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)sgRNA寡核苷酸的设计和构建；

(2)sgRNA的功能验证；

(3)PBMC细胞的制备；

(4)基因敲除T细胞的制备。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)sgRNA寡核苷酸的设计和构建，步骤为：

1)明确T细胞免疫检测点通路基因目标DNA区域，选定具有Cpf1核酸酶蛋白识别PAM位点特征区域为特异性靶序列；

2)按照步骤1)选定的特异性靶序列，合成sgRNA引物对，引物对包含：具有5’-AGAT-N_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAA-N_X-3’特征的反向寡核苷酸链，退火形成双链DNA；

3)对pGL3-U6-sgRNA质粒进行线性化；

4)将步骤2)获得的双链DNA和3)获得的线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行连接，得连接产物；

5)将步骤4)中所获得的连接产物转化DH5α感受态细胞并涂平板，挑取克隆测序，测序结果正确的克隆即为含有sgRNA质粒的克隆。

3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)sgRNA的功能验证，步骤为：

1)细胞培养与转染，将HEK293T细胞接种于细胞培养板中，待细胞长到培养板的70-80％时，将步骤(1)得到的sgRNA质粒和sgCpf1质粒共转染至HEK293T细胞中，然后药杀48小时后收集细胞；

2)T7EN1酶切检测，将步骤1)中收集的细胞进行DNA提取，并在sgRNA位点上下游设计引物F和引物R，并用引物F和引物R对所提取的DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物，然后对PCR扩增产物进行纯化回收，得PCR回收产物，取回收产物进行T7EN1酶切，然后进行电泳检测；

3)T-A克隆测序，将T7EN1酶切检测后的PCR回收产物进行T-A克隆，挑取单克隆，并测序验证。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)基因敲除T细胞的制备，步骤为：

1)将步骤(1)得到的sgRNA质粒和sgCpf1质粒共转染步骤(3)获得的PBMC细胞；

2)采用偶联CD3/CD28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞；

3)筛选并培养步骤2)扩增转染后的阳性T细胞，获得基因敲除T细胞。

5.如权利要求1-2所述的方法，其中，步骤(1)-1)中所述的T细胞免疫检测点通路基因为程序性死亡受体-1基因、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白基因、淋巴细胞活化基因-3或T细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3基因中的任意一种。

6.如权利要求1-2所述的方法，步骤(1)-1)中所述的特异性靶序列，为选择PAM结构3＇端相邻的18-25bp DNA序列作为靶序列，其中PAM位点特征5’-TTTN-3’，N表示A、G、C、T中的任一种。

7.如权利要求1-2所述的方法，其中，步骤(1)-2)中所述的具有5’-AGAT-N_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAA-N_X-3’特征的反向寡核苷酸链中的N代表A、G、C、T中的任一种；

其中，所述的X为整数，且18≤X≤25；

其中，所述的正向寡核苷酸链中的N_X和反向寡核苷酸中的N_X具有反向互补特征，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段。

8.如权利要求1-2所述的方法，步骤(1)-2)中所述的sgRNA引物对为：

9.用权利要求1-8所述的方法制备得到的基因敲除T细胞，所述的基因敲除T细胞为PD-1基因敲除T细胞、CTLA4基因敲除T细胞、LAG3基因敲除T细胞或TIM-3基因敲除T细胞中的任意一种。

10.如权利要求9所述的基因敲除T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。