[发明专利]一种对T细胞免疫检测点通路进行基因敲除的方法及应用

说明书

本发明提供了一种利用CRISPR‑Cpf1/sgRNA快速、简单、高效、特异性敲除T细胞免疫检测点通路基因的方法，有效解决了利用CRISPR‑Cas9系统对PD‑1、CTLA‑4、LAG‑3和TIM3基因敲除的缺陷。本发明的具体步骤包括：明确T细胞免疫检测点通路基因的目标DNA区域，根据选定的目标DNA区域，设计sgRNA引物对，并利用CRISPR‑Cpf1系统特异性定向敲除T细胞免疫检测点通路基因。本发明简单易行，免疫检查点敲除T细胞有效性更好，安全性更高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域；具体涉及T淋巴细胞的改造；更具体的,涉及利用CRISPR-Cpf1系统制备阻断免疫检查点T细胞及制得的T细胞及其应用。

技术背景

恶性肿瘤发病率和死亡率高居不下，是威胁人类健康的头号杀手，寻找有效的肿瘤治疗方法，彻底攻克肿瘤是世界医学界的重要研究课题。近年来，随着基因工程技术的发展，对于免疫调节机制认识的加深，以及更多抗肿瘤免疫调节药物的实验数据支持，免疫检查点治疗药物已成为对抗肿瘤的新手段。

免疫检查点阻断成为细胞免疫治疗的研究热点，也是当前靶向基因治疗最成功的的领域,免疫检查点控制共刺激和共抑制信号的平衡，而免疫检查点的平衡使T细胞的免疫效应保持适当的深度、广度，从而最大程度减少对于周围正常组织的损伤，维持对自身组织的耐受、避免自身免疫反应。然而，肿瘤细胞可异常上调共抑制分子及其相关配体，抑制T细胞的免疫活性，进而造成免疫逃逸。目前，针对肿瘤的免疫治疗研究的热点，且较为成熟的免疫检查点有：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(T-lymphocyte antigen-4,CTLA-4)、程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)、淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyteactivationgene-3,LAG-3)、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白-3(T-cell immunoglobulin and mucin-3)等。其中PD-1的主要功能是限制外周组织的效应T细胞活性，肿瘤细胞表达的PD-1配体和T细胞的PD-1结合，抑制体细胞激活相关激酶，从而抑制效应T细胞活性；CTLA-4主要表达在活化的T细胞或自然杀伤细胞中，当与抗原呈递细胞表面的B7-1(CD80)/B7-2(CD86)结合后，CTLA-4可以负向调节T细胞的活化，导致T细胞应答的下调；TIM-3是免疫调节分子TIM家族成员，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，高表达于Th1和细胞毒性T细胞(Tc1)上，与其配体半乳糖凝集素-9(Galectin-9)相互作用时，可导致Th1和Tc1的细胞凋亡；LAG-3属于免疫球蛋白超家族，主要表达于活化的T细胞和NK细胞表面，与MHC-Ⅱ亲和力高，当与配体结合后可抑制Th1细胞增殖和IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子的分泌，同时LAG-3同样能抑制CD8⁺T细胞活性，抑制细胞毒性作用。

免疫检查点的阻断，则是指利用T细胞免疫检查抑制性受体的单克隆抗体，特异性阻断抑制性受体与其配体的结合，从而阻断免疫检查机制抑制T细胞活化的作用，增强效应T细胞的抗肿瘤效果。免疫检查点抑制剂治疗除CTLA-4、PD-1、PD-L1外，新的免疫检查点如LAG3、TIM-3、VISTA、A2aR、CD160等的研究也在不断的进行中，然而，当前临床上阻断性抗体也具有其不可避免的缺陷，如：抗体作用只是暂时阻断的作用；抑制性受体有多种，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体还没有对策；不容易研发出有效的抗体；只针对细胞外靶点；抗体药物昂贵；抑制剂总体缓解率相对较低；长期应用免疫检查点抑制药可使免疫耐受性不平衡导致免疫检查点无检查点免疫反应等。

为解决上述药物制剂的弊端，已有中国专利CN201410077474.6提供了一种快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过提供精准特异性靶向PD-1基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术，达到特异性敲除PD-1基因的目的。