[发明专利]一种毕赤酵母高效基因敲除方法

权利要求书

1.一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1. 通过质粒pYES2构建敲除质粒pGE1203-ADE-URA3；

S2.将敲除质粒分别敲入所述毕赤酵母组中目标基因och 1的上游、下游；

S3. 具有敲除质粒活性的蛋白质识别、剪切所述核苷酸序列，敲除所述目标基因och1，获得敲除所述目标基因och 1的毕赤酵母。

2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，步骤S1中，所述敲除质粒pGE1203-ADE-URA3的构建方法为：

以质粒pYES2为模板，通过扩增引物P1和P2进行PCR反应，生成pGE1201；

通过已知毕赤酵母菌株为模板，设计目标基因och 1的同源臂序列P3和P4；

通过毕赤酵母URA3基因设计寡核苷酸引物P5和P6；

通过酿酒酵母ADE基因设计寡核苷酸引物P7和P8；

将och 1 5’端同源臂以Bam H I/Not I酶切，克隆到用Bam H I/Not I酶切的pGE1201质粒上，形成pGE1202，再将3’端同源臂以Not I和Kpn I酶切，克隆到用Not I和Kpn I酶切的pGE1202上，形成pGE1203；再将URA3基因以Pst I/Kpn I酶切，克隆到同样用Pst I/Kpn I酶切的pGE1203上，形成pGE1203- URA3；将pGE1203- URA3以Not I酶切，再用CIAP去磷酸化，与同样用Not I酶切的ADE基因连接，形成敲除质粒pGE1203-ADE-URA3。

3.根据权利要求2所述的一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，所述质粒pYES2扩增引物序列如：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求2所述的一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，所述目标基因och 1的同源臂序列如：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求2所述的一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，所述毕赤酵母URA3基因设计寡核苷酸引物序列如：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

6.根据权利要求2所述的一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，所述酿酒酵母ADE基因设计寡核苷酸引物序列如：SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

7.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，步骤S3中，其具体方法包括将敲除质粒pGE1203-ADE-URA3以5’端同源臂上的Bgl Ⅱ酶切位点线性化，电击转入制备好的JC308感受态细胞中，涂布于含有精氨酸和组氨酸的MD培养基上，30℃培养1-2.5天。