[发明专利]一种毕赤酵母高效基因敲除方法

说明书

本发明提供一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，包含以下步骤：S1.通过质粒pYES2构建敲除质粒pGE1203‑ADE‑URA3；S2.将敲除质粒分别敲入所述毕赤酵母组中目标基因och 1的上游、下游；S3.具有敲除质粒活性的蛋白质识别、剪切所述核苷酸序列，敲除所述目标基因och 1，获得敲除所述目标基因och 1的毕赤酵母。本发明有效改善毕赤酵母对蛋白的糖基化修饰，解决融合蛋白过度糖基化的问题，对毕赤酵母och1基因进行了高效敲除。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母高效基因敲除方法。

背景技术

近年来，随着基因工程和细胞工程技术的发展，众多目的基因在原核和真核细胞中被克隆和表达出来，以此提高外源蛋白的表达能力。长期以来，大肠杆菌一直被用作表达外源基因的宿主菌，并成功地表达了多种外源蛋白，但是它不能表达结构复杂的蛋白质，且分泌型表达产量较低。而酵母作为一种表达外源基因的宿主菌，既具有原核生物生长特性、操作简单，又具有真核细胞的翻译后修饰加工特性。在表达某些基因工程产品时，可以大规模生产，

从而有效地降低成本。其中，酿酒酵母是最早用来作为异源蛋白基因表达系统并加以应用的酵母系统，然而研究表明，其并不是表达外源基因的理想宿主菌。直至1969 年，Ogata 等首次发现一种嗜甲醇酵母—巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），它可以在甲醇为唯一碳源的条件下生长，其中，醇氧化酶（Alcoholoxidase，AOX）是甲醇代谢途径中的第一个酶，它可以将甲醇氧化成甲醛和过氧化氢，在以甲醇为唯一碳源的条件下，AOX1 可占到细胞分泌总

蛋白的30%。经过近几十年的发展，目前，巴斯德毕赤酵母已成为最广泛的外源蛋白表达系统之一。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）具有其他表达系统所无可比拟的优越性：生长速度快，表达量高，能对外源基因进行正确翻译和修饰，克服了大肠杆菌表达蛋白结构简单，表达量低的缺点，也克服了酿酒酵母系统缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等缺点并且自身分泌的背景蛋白少，糖基化程度低，对营养要求低，可采用廉价的培养基，可实现高密度发酵。有研究表明，利用毕赤酵母生产重组蛋白A，经68 h 的诱导后，rSPA 产量可达8.8 g/L，占发酵液中总蛋白的80% 以上，较大肠杆菌表达系统有明显提高；通过对来自大肠杆菌和毕赤酵母的rLTB 的特性作了比较，其结果表明，rLTB 在

毕赤酵母中的表达量是其在大肠杆菌中的6 倍且具有更高的活性，具有显著的优势。正是由于这些优点，使得巴斯德毕赤酵母迅速发展成为分子生物学、医学、生物工程学等领域中的研究热点。

但是同时研究发现，巴斯德毕赤酵母外源表达系统的不足。在表达外源蛋白时，巴斯德毕赤酵母重组菌往往存在比较严重的蛋白降解现象。酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰，产生高甘露糖型糖链，影响蛋白活性，从而限制了巴斯德毕赤酵母表达人源型蛋白表达在医药方面的应用。只有通过对其转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理有进一步的了解，才能够寻找出一种有效地通过相关基因敲除达到影响表达蛋白途径的方法，实现改良的毕赤酵母重组菌的构建。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种毕赤酵母高效基因敲除方法，有效改善毕赤酵母对蛋白的糖基化修饰，解决融合蛋白过度糖基化的问题，对毕赤酵母och 1基因进行了高效敲除。

本发明的技术方案为：一种毕赤酵母高效基因敲除方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1. 通过质粒pYES2构建敲除质粒pGE1203-ADE-URA3；