[发明专利]一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法

说明书

本发明公开了一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，包括以下步骤：步骤(1)制备待测定的木聚糖酶液样品；步骤(2)在垂直电泳槽内制备分离胶，再在分离胶上层上制备具有样品槽的浓缩胶层；步骤(3)在浓缩胶的样品槽中点样后，对垂直电泳槽施加电压，跑胶；步骤(4)利用割胶板将样品所在泳道的胶切成条状，去除浓缩胶，保留分离胶，即获得包含样品的条状分离胶；将包含样品的条状分离胶，放入乙酸钠溶液中，孵育；步骤(5)将孵育后的包含样品的条状分离胶紧密贴在培养皿中的底物胶的胶面上，将培养皿放置在30‑50℃的生化培养箱中，培养1‑36小时，直至有清晰的条带和透明圈出现。本发明中操作简单，且采用同一块胶，能够同时鉴定出木聚糖酶蛋白条带及活性。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，更具体的说是涉及一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法。

背景技术

木聚糖是一种植物细胞壁多糖，约占植物细胞干物质的15-35％，是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于秸秆、麦麸、玉米芯等农业副产物中，含量非常丰富。通过木聚糖酶可将木聚糖分解成不同长度的低聚木糖和木糖，进而使这些资源被充分利用，发挥其潜在的应用价值。木聚糖酶已广泛应用于饲料、食品、造纸和能源等领域，带来了很大的经济效益。

目前木聚糖酶的生产主要来源于微生物发酵，包括自然界中分泌木聚糖酶的微生物以及利用基因工程技术构建的含重组木聚糖酶基因的工程菌(陈洪洋等，木聚糖酶的研究进展，中国酿造，2016(11)：1-5)。在利用微生物生产木聚糖酶过程中，往往需要对木聚糖酶的特性、活性、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胶(Native-Page)中的位置、以及是否存在同工酶等情况进行鉴定，以便与木聚糖酶的纯化，这需要酶谱技术。酶谱技术是利用电泳技术结合特异的酶促化学反应显色对酶及其同工酶进行分析的方法。根据酶蛋白分子的大小和所带电荷量的不同，通过电泳使之分离，并利用酶的催化活性作用于底物，用不同方法显现出酶蛋白的特征性电泳谱带(酶谱)后进行判型(官大威，法医学辞典：化学工业出版社，2009年)。对于木聚糖酶，酶谱技术主要有两大用途，一是鉴定样品中是否存在有活性的木聚糖酶，蛋白条带处于什么位置；二是，样品中是否存在木聚糖酶的同工酶。目前用于木聚糖酶鉴定的酶谱法，多采用Native-Page与刚果红染色相结合的方法(Ninave等，Purification and sharacterization of extracellular xylanase from Streptomycescyaneus SN32，Bioresource Technology，2008，99：1252-1258)，但这种方法存在不易着色，操作繁琐，且需要额外一条Page胶与酶谱胶相对应以确定目的条带，由于不是同一块胶，两块胶间存在有偏差的风险。

因此，寻找一种简单易操作的木聚糖酶酶谱鉴定方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，采用酶谱法，操作及着色简单，且采用同一块胶就能够鉴定出木聚糖酶蛋白条带及活性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种鉴定木聚糖酶蛋白条带及活性的酶谱方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)制备待测定的木聚糖酶液电泳样品；

步骤(2)制备分离胶层，再在分离胶上层上制备具有样品槽的浓缩胶层；

步骤(3)将步骤(2)制备的胶放在垂直电泳槽中并加满Tris-甘氨酸缓冲液，再在浓缩胶层的样品槽中点样后，对所述垂直电泳槽施加电压，跑胶，直至木聚糖酶液样品中的溴酚蓝条带跑至垂直电泳槽的底层为止；

步骤(4)利用割胶板将木聚糖酶液样品所在泳道的胶切成条状，去除浓缩胶层，保留分离胶层，即获得包含样品的条状分离胶；将所述包含样品的条状分离胶，放入乙酸钠溶液中，孵育；