[发明专利]重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌zjut‑ho1及其在制备胆绿素中的应用，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。该重组大肠杆菌表达胞内活性的HO‑1，可以利用重组大肠杆菌为HO‑1酶源，以氯化血红素为底物，生物转化法制备胆绿素，为胆绿素的生产提高新途径。相比于现有的同类技术，本发明将原核生物来源的ho1在原核生物的大肠杆菌中表达，具有HO‑1活性高、培养周期短等优点，并以氯化血红素为底物，使胆绿素的产率有大幅度提高，是重组大肠杆菌全细胞合成法的2.6倍。

(一)技术领域

本发明涉及一株表达藻类来源的血红素加氧酶-1的基因重组大肠杆菌，以及该菌株在生物转化血红素制备胆绿素中的应用。

(二)背景技术

胆绿素(biliverdin，CAS：114-25-0)是由血红素经血红素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)水解开环而得到的一种线性四吡咯环物质(反应式见图1)，因其呈深绿色而得名。在脊椎动物细胞内，血红素在HO-1的水解作用下，在α-亚甲基桥处开环形成胆绿素IXα异构体，因此，胆绿素一般就是指胆绿素IXα。

胆绿素不仅仅是血红素代谢循环系统的一个中间代谢物，更重要的是它能启动一系列的抗炎、抗氧化和免疫调节等生理作用，如可以改善肝功能、降低丙氨酸转氨酶、减轻因肝脏移植导致的缺血再灌注损伤，抑制新生血管内膜形成的血管重塑，以及抑制牛腹泻病毒复制等功能。因此，胆绿素作为临床药物使用的潜力巨大。所以，近年来，如何高效制备胆绿素一直是科研人员关注的热点。

目前，制备胆绿素主要有提取法、化学转化法、酶转化法和生物合成法。提取法是直接从三文鱼胆汁或鸸鹋蛋壳中提取胆绿素，存在的问题是原料来源不足，难以工业化应用；化学转化法是利用胆红素脱氢制备，但该方法存在2个问题：①需要价格高的胆红素作为底物，原料来源困难；②胆红素提取自哺乳动物的胆汁，而且需在酸性条件下，这使胆红素形成多种异构体，从而导致产物胆绿素IXα的收率和纯度较低；也有采用化学氧化血红素法制备胆绿素的报道，同样产生较多的异构体，收率较低；酶转化法制备胆绿素的报道是美国的一项专利，将来自蓝藻的HO-1基因重组到酵母细胞中，表达HO-1，再以血红素作为底物，全细胞生物转化制备胆绿素，该方法的优点是异构体少，但该专利未报道产率情况。生物合成法的报道是于2012年，美国犹他州立大学的Chen和Takemoto将蓝藻的HO-1基因重组到大肠杆菌，重组大肠杆菌全细胞能够合成胆绿素，胆绿素产率可达23.5mg/L，即便如此，产率仍然相对较低。可以看出，目前缺乏经济有效的胆绿素制备方法。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株表达集胞藻(Synechocystis sp.)的胞内活性血红素加氧酶-1基因(ho-1)的基因重组大肠杆菌，经诱导表达培养后，在培养液中加入氯化血红素作为底物，在胞内HO-1的催化作用下，用于生物转化法制备胆绿素，获得相对较高的胆绿素收率，为胆绿素的生产提供新方法。

本发明的采用的技术方案是：

本发明提供一株表达胞内活性血红素加氧酶-1基因(HO-1)的重组大肠杆菌(Escherichia coli)zjut-ho1菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

所述大肠杆菌zjut-ho1菌株的构建方法包括以下步骤：

(1)以集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803总RNA逆转录得到的双链cDNA为模板，设计引物P1和P2，引入限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位点，PCR扩增获得目的基因ho1序列，所述的基因ho1的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。

所述的引物P1和P2分别为：