[发明专利]量子点纳米复合物、其制备方法及应用

说明书

本发明提供一种量子点纳米复合物、其制备方法及应用，具体所述量子点纳米复合物为在量子点探针表面化学偶联外泌体膜的生物识别因子CD63适配体。所述应用为利用共聚焦显微镜成像技术示踪干细胞来源的外泌体与代谢器官(肝、肺、肾)的细胞相互作用的情况。具体条件为Apt/QDs的比例为2μL:1μg。干细胞源外泌体与代谢器官细胞共孵育时间为5～8h，成像比例为20～40μg外泌体与2～4*10⁴/mL细胞。本发明以外泌体为技术平台，对量子点‑适配体纳米探针标记的外泌体代谢路径进行体外研究，为后续外泌体载药等体内及临床研究提供技术支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种量子点纳米复合物、其制备方法及应用。

背景技术

外泌体(Exosomes,Exo)是由细胞分泌的直径为30-150nm的囊泡，承担细胞间通讯和物质转运等职能。由于外泌体携带蛋白质和RNA等，并具有低免疫原性，其用作疾病标志物和靶向药物载体的研究成为热点。研究表明，干细胞来源的外泌体具有修复的功能，特别是在退行性疾病和神经炎性疾病中。此外，与外泌体相关的特异性标记物可用于监测癌症。为进一步将干细胞源外泌体用于临床治疗，研究者需全面掌握其代谢情况。对于外泌体的研究仍处于早期阶段，受纳米尺寸的限制且不同细胞类型分泌的外泌体其体内代谢路径势必不同。标记外泌体探究其在体内的代谢情况，成为重大挑战。

量子点(Quantum Dots,QDs)是一种半导体荧光纳米晶体，由IIB-VIA或IIIA-VA族元素组成，粒径小于10nm，具有良好的光化学稳定性及生物相容性，且激发光谱宽，发射光谱窄，荧光寿命长，不易猝灭等特点。量子点作为荧光标记物，具有较高的灵敏度，在细胞示踪和生物检测方面具有重要的应用价值，目前广泛应用于生物标记、生物传感和生物成像的研究中。因此，设计出稳定，通用且多样化的量子点纳米探针对于量子点在生物医学中的应用有重要的价值。

适配体(Aptamer,Apt)是人工合成的单链DNA或RNA序列，通过分子内折叠，能够以高亲和力特异性地结合目标蛋白。具有易合成，易修饰，易扩增，分子量小，稳定性强的特点，因而在分子生物学领域得到了广泛的应用。适配体具有广泛的配体范围，可以通过SELEX系统筛选出来。随着技术的发展，越来越多外泌体表面特定蛋白相对应的适配体将被发现，适配体为标记外泌体的应用带来了新的方向。

因此利用量子点的荧光信号搭载适配体特异性结合外泌体表面蛋白的特性，针对干细胞源外泌体进行代谢路径的研究，实现外泌体的示踪，对外泌体应用于临床疾病诊断及治疗具有重大意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明采用的技术方法如下：

首先，本发明制备一种量子点纳米复合物，即量子点-适配体纳米复合物(特异性的量子点适配体荧光探针，Apt/QDs)，在量子点探针表面化学偶联外泌体膜的生物识别因子CD63适配体用于特异性标记。

所述量子点适配体荧光探针制备方法，具体步骤如下：

将带有氨基基团的水溶性量子点通过交联剂磺基-SMCC[(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，钠盐]Sulfo-SMCC与巯基修饰的序列CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA的CD63适配体进行偶联。

本发明的另一方面在于，公开上文所述量子点纳米复合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)避光条件下，取浓度为8～10μM的氨基水溶性量子点，再加入等体积的浓度为4～5μM的Sulfo-SMCC，室温摇床反应1～2h；

(2)取步骤(1)所得的反应液在10000～12000rpm离心除去沉淀；取上清加入到脱盐柱NAP-5columns中，用PBS洗脱，收集有荧光的溶液加入至1OD CD63适配体中，避光震荡2～4h后，加入半胱氨酸封闭；