[发明专利]一种检测花生黑腐病菌的LAMP引物组及其快速检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测花生黑腐病菌的LAMP引物组及其快速检测方法和试剂盒。所述LAMP引物组包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP；其核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5所示。本发明提供的LAMP引物组合可用于花生黑腐病菌的快速检测，且本发明提供的检测方法成本低、操作简单、实用性好，不需要昂贵的仪器设备，仅需要一台可控温的水浴锅即可完成反应；反应结果易判断，且检测灵敏度高、特异性强，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明涉及植物病原物检测和植物病害防治技术领域，更具体地，涉及一种检测花生黑腐病菌的LAMP引物组及其快速检测方法和试剂盒。

背景技术

花生黑腐病是由冬青丽赤壳Calonectria ilicicola（无性态为寄生柱帚霉Cylindrocladium parasiticum）引起的一种真菌性病害，该病害为害花生的果针、荚果和根系，造成受害部位变黑腐烂，植株萎蔫死亡，是一种毁灭性的病害。该病害最早由Bell和Sobers在美国的乔治亚州发现，目前已传播蔓延至日本、韩国和澳大利亚等30多个国家（潘汝谦等，2012），在美国的花生产区造成的产量损失在10%左右（Bell and Sobers，1996）。2009年，Pan等在我国的广东省首次发现花生黑腐病，随后该病害迅速蔓延至我国的江西省和福建省等地区，对我国的花生生产造成严重威胁（Pan al.，2012；Gai et al.，2012）。花生黑腐病菌不但可以侵染花生，还可以为害大豆（Guan et al.，2010）。除此以外，Cy. parasiticum 还可侵染中华猕猴桃、欧洲夹竹桃和紫花苜蓿等20多种其他植物。潘汝谦等对花生黑腐病菌在中国的风险性进行了评估，认为Cy. parasiticum属于高度风险性有害生物，对中国的花生和大豆等作物的生产及生物安全等构成严重威胁（潘汝谦等，2012）。我国新修订的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为我国新的检疫性病害。

花生黑腐病是典型的土传和种子传播病害，病害一旦发生，生产上防控极为困难，病害的早期诊断对防止病害传播蔓延和病害防控尤为重要。但是，传统的鉴定技术耗时长，往往错过病害的最佳防治时机，而且操作专业要求高，农民不易掌握。因此，有必要建立一种简单、快速、高效的花生黑腐病菌快速检测技术，为病害的早期诊断提供技术支持。

环介导等温扩增反应（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是近年发展起来的一种新的恒温核酸扩增方法，该技术特异性强、灵敏度高，最大的特点是简单易行、成本低。反应在恒温条件下1～1.5个小时即可完成，结果通过肉眼观察产物浊度或颜色变化即可判断。LAMP技术自2000年问世以来，在植物病害检测方面得到了广泛应用。在植物真菌病害方面，迄今已经建立了栎树猝死病菌（Phytophthora ramorum）、大豆根腐病菌（P. sojae）、桉树焦枯病菌（Cy. scoparium）、大豆炭疽病菌（Colletotrichum truncatum）和雪松根腐病菌（P. lateralis）（Tomlinson et al.，2007；Dai et al., 2011；张静等，2015；田擎，2016；纪睿等，2017）等植物病原菌的检测方法。

由于LAMP技术田间检测不需要特殊的仪器设备，仅一台可控温的水浴锅即可，检测成本低，操作又简单、快速，因此该技术在植物病害的田间检测上将会有广阔的应用前景，但是目前还未见有针对花生黑腐病的相关快速检测方法的报道。

发明内容