[发明专利]一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，将编码酰基转移酶的基因、编码脂酰CoA合成酶的基因、编码烯酰ACP还原酶的基因、编码甘油激酶的基因、编码3‑磷酸甘油酰基转移酶的基因和编码DAGP磷酸酶的基因导入大肠杆菌，得到重组菌。经过发酵，实现了1,2,4‑丁三醇油酸酯的首次合成。本发明所构建的重组菌，在LB培养基中发酵24h，可以实现丁三醇和油酸钠的酯化，得到丁三醇油酸酯，为丁三醇的分离纯化提供新的思路。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用。

背景技术

1,2,4-丁三醇(丁三醇，BT)是一种与甘油相似的无色透明物质，其主要作用是作为有机合成的化学中间体，广泛的应用于JG、烟草、化妆品、造纸、医药和高分子材料等领域。其硝化衍生物相比硝酸甘油有热稳定性好，毒性、挥发性较小，冲击感小等优点，需求量逐年增加。目前，各国学者开展了一系列生物法合成BT的研究，取得了较大进展。但丁三醇属于醇类物质，易溶于水，难于从发酵液中分离。Frost团队曾经使用真空蒸馏法分离，但是在获得的产物中，有聚合物和降解物的污染；液相萃取的方法也有研究，实验结果表明乙酸乙酯和2-丁酮虽然可以萃取丁三醇，但是其萃取效率偏低；1-丁醇和2-丁醇可以高效萃取丁三醇，但是杂质偏多；目前还没有找到比较理想的萃取剂。

醇类物质和酸类物质可以很容易进行酯化反应。酯类物质难溶于水，并且易于水解重新得到醇类物质，现有的水解技术也比较成熟。有研究通过化学法将发酵液中的乳酸和甲醇、乙醇等低级醇类实现酯化，进一步离心水解获得乳酸，乳酸的回收率达到90％以上；相比传统的分离方法简化了实验步骤，减少了环境污染。BT作为醇类物质，同样可以实现酯化反应。但是目前合成BT的方法普遍为化学方法，而化学方法合成BT存在条件苛刻、污染严重等问题，所以开发新的BT合成方法是目前需要解决的问题。目前，已经有研究使用生物方法合成BT，但是仍然存在发酵液中的BT难以分离的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种合成丁三醇油酸酯的重组菌及其构建方法和应用。

本发明首先提供了一种合成丁三醇油酸酯的重组菌。

所述重组菌过表达编码酰基转移酶的基因yqeF、编码脂酰CoA合成酶的基因fadD、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI、编码甘油激酶的基因glpK、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB；出发菌株为大肠杆菌。

所述的编码酰基转移酶的基因yqeF、编码脂酰CoA合成酶的基因fadD、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI、编码甘油激酶的基因glpK、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB来源于大肠杆菌。

所述编码酰基转移酶的基因yqeF在NCBI的基因ID为947324，编码脂酰CoA合成酶的基因fadD在NCBI的基因ID为946327、编码烯酰ACP还原酶的基因fabI在NCBI的基因ID为945870、编码甘油激酶的基因glpK在NCBI的基因ID为948423、编码3-磷酸甘油酰基转移酶的基因plsB在NCBI的基因ID为948541和编码DAGP磷酸酶的基因pgpB在NCBI的基因ID为945863。

本发明还提供构建上述重组菌的方法，包括以下步骤：

1)克隆酰基转移酶基因yqeF，将所得基因与质粒pACYCDuet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pACYCDuet-yqeF；

2)克隆脂酰CoA合成酶基因fadD，将所得基因与步骤1)所得载体pACYCDuet-yqeF进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒获得重组载体pACYCDuet-yqeF-fadD；