[发明专利]含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法

说明书

本发明公开了含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法。所述大肠杆菌表达系统中的重组表达质粒为以下几种情形之一或其组合：(1)至少包含大肠杆菌分子伴侣基因和含锰离子的酶蛋白基因；(2)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及过表达或抑制锰离子通道相关蛋白基因；(3)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及影响胞内的锰离子浓度相关蛋白基因。通过所述大肠杆菌表达系统的构建及优化，可实现含锰离子酶蛋白的高效可溶且有活性的表达，相比传统方法效率高、纯化工艺简单、成本低，有利于含锰离子酶的工业化生产和应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法。

背景技术

大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统(戎晶晶等.大肠杆菌表达系统的研究进展.药物生物技术,2005,12(6):416-420；解庭波,大肠杆菌表达系统的研究进展.长江大学学报(自然科学版),2008,5(3):77-83)。近年来的研究表明，在科研和工业上被广泛应用的大肠杆菌表达载体主要有pGE系列、pQE系列和pET系列，其中目前被广泛应用的高效表达载体是pET，此系统是在大肠杆菌中表达外源蛋白最高效、产量最高、成功率最高的表达载体。它最初是利用与启动子配套并且能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶构建的T7RNA聚合酶/启动子系统，可以从各种基因(包括原核细胞、真核细胞)生产大量的目的蛋白(祁浩等.大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展.安徽农业科学,2016,44(17):4-6)。pET系统有11种不同DE3溶原化宿主菌，其中使用最广泛的为BL21及其衍生菌株。Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。

尽管大肠杆菌表达系统作为目前应用最广泛的蛋白质表达系统具有较多的优点，但也存在一些不足，常常出现表达的蛋白质形成包涵体或被蛋白酶降解的情况，原因大多是表达的蛋白质没能进行正确的折叠。另外，包涵体蛋白纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。目前有助于提高目的蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达的实验方案主要有：(1)降低蛋白合成的速度；(2)改变培养基；(3)与分子伴侣或折叠酶共蛋白表达。大肠杆菌中常用的分子伴侣有：GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE和ClpB；大肠杆菌中常用的折叠酶有:PPI's、DsbA、DsbC和PDI；(4)分泌表达，使目的蛋白分泌到周质空间。周质空间有折叠酶DsbA和DsbC的存在，帮助蛋白正确折叠；(5)使用特定的菌株，如AD494或Origami菌株；(6)与可溶性标签蛋白融合表达；(7)体外去折叠，重新折叠。

商业化的分子伴侣质粒中应用最多的是Takara公司的Chaperone Plasmid Set，含有五种类型的质粒，每一种质粒都能有效表达不同类型的伴侣蛋白组，各伴侣蛋白组协同作用、共同参与蛋白质折叠。据报道，目的蛋白质与其中一种“Chaperone team”共同表达，便可增加可溶性蛋白质的回收率而使用通常方法，由于包涵体的形成，这些表达蛋白质常常是不可回收的。