[发明专利]一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了属于生物技术和生物化工领域的一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用。所述高产脂肽的基因工程菌，其是将生物素羧化酶基因转化至原始菌株构建而成，其过表达生物羧化酶。本发明的基因工程菌，在产脂肽枯草芽孢杆菌细胞中扩增并表达了生物素羧化酶YngH，强化了表面活性素分子结构中脂肪酸的合成，从而显著提高了脂肽的产量。本发明所得过表达生物素羧化酶YngH的基因工程菌与出发菌株相比，表面活性素产量最高可以提高47％，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

脂肽(lipopeptide)类生物表面活性剂是一类由亲水的环状寡肽与疏水的脂肪酸链以内酯键连接而成的两性物质，主要由芽孢杆菌、链霉菌等微生物合成。由于组成脂肽的肽环中氨基酸组成与成环方式不同，芽孢杆菌脂肽可分为表面活性素、芬芥素、伊枯草菌素等，其中在气/液界面形成独特“马鞍”构象的表面活性素具有良好的表面活性、生物降解性及抗菌活性，在石油开采、生物防治、医药及日化等领域都有广阔的应用前景。但由于芽孢杆菌发酵生产表面活性素产率低限制了表面活性素的工业化生产和应用。

目前，提高微生物脂肽发酵水平的方法包括培养条件优化、诱变育种、强化表面活性素跨膜运输、强化表面活性素合成酶表达等。专利文献(CN 101892176A、CN 101775427A、WO 2002026961A)等通过对枯草芽孢杆菌发酵生产表面活性素发酵过程中培养基及培养条件进行优化，提高了发酵液中表面活性素的产量。诱变育种方面，CN101928677A公开了通过紫外诱变处理玫瑰孢链霉菌，US05227294公开了用亚硝基甲替尿烷处理枯草芽孢杆菌，上述文献中的微生物在诱变处理后，其表面活性素合成量都有增加。基因工程改造方面，中国专利文献CN103898038 A公开了通过强化脂肽由胞内向胞外运输的跨膜蛋白YcxA，枯草芽孢杆菌发酵生产的表面活性素产量提高了97％。中国专利文献CN1554747A公开了在枯草芽孢杆菌中表达comA基因，脂肽产量提高了50％。另外，枯草芽孢杆菌中脂肪酸和氨基酸在表面活性素合成酶的作用下催化合成表面活性素，中国专利文献CN105400784A通过将脂肽合成酶基因簇启动子替换成诱导型强启动子Pg3，表面活性素产量提高了17.7倍。(Dhali D,Coutte F,Arias AA,et al.Genetic engineering of the branched fatty acidmetabolic pathway of Bacillus subtilis for the overproduction of surfactinC14 isoform[J].Biotechnology journal,2017,12(7):1600574.)公开了敲除枯草芽孢杆菌中催化支链氨基酸生成脂肪酸的BKD操纵子中的lpdV基因，表面活性素产量提高了1.4倍。上述方法中都增加了表面活性素的产量，但是关于强化细胞中脂肪酸合成来提高表面活性素产量的研究未见报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺点，本发明的目的在于提供一种高效的生产脂肽的基因工程菌，其可以提高脂肽的产量。

一种高产脂肽的工程菌其是将生物素羧化酶基因转化至原始菌株构建而成，其过表达生物羧化酶。

上述基因工程菌中，所述生物素羧化酶为YngH蛋白或其具有相同功能的突变体。

上述基因工程菌中，所述YngH蛋白其具有相同功能的突变体是指因为基因序列改变，但是表达后具有和YngH蛋白相同或相似的功能的YngH蛋白的突变体。

上述基因工程菌中，优选的，所述YngH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基因工程菌中，优选的，YngH蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基因工程菌中，所述原始菌株为具有产脂肽能力的野生菌及其诱变株、突变株或基因工程改造菌株。