[发明专利]一种检测小麦矮缩病毒DNA的方法

权利要求书

1.一种检测小麦矮缩病毒DNA的方法，特征在于，其包括以下步骤：

S1：提供特异性识别小麦矮缩病毒DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G-四链体互补序列的核苷酸序列；

S2：将所述DNA分子机器与待测样品相混合；

S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA新链合成、形成单链切口、不断剥离产生富G序列片段的系列反应；

S4：引入硫黄素T，诱导富G序列片段产生G-四链体结构，与G-四链体结合，产生荧光；

S5：记录荧光发光情况。

2.如权利要求1所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述的DNA分子机器从5’端到3’端依次是G-四链体合成模板、切口酶识别区、稳定区和靶序列识别区。

3.如权利要求2所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述靶序列识别区与小麦矮缩病毒DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，且所述G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。

4.如权利要求1所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述S3中，加入dNTP和缓冲液，并置于恒温条件下扩增；所述S4中，加入金属阳离子参与反应。

5.如权利要求4所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述恒温的温度为45-65℃，扩增时间为15-30min。

6.如权利要求1所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述S5中，每隔30s读取一次荧光并记录；所述记录方式为，对比溶液的颜色深浅的书面描述、拍照、录像或者测定吸收光谱。

7.如权利要求4所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述S2中的待测样品的浓度为2～8μM，所述DNA分子机器的浓度为1～120nM，将待测样品与DNA分子机器混合均匀，得到混合溶液；

步骤S3中将所述缓冲液10～40μL、聚合酶6～10μL、切口酶6～10μL和dTP3～10μL加入S2中的混合溶液中参与反应，得到反应液；

步骤S4中将所述硫黄素T6～10μL、金属阳离子6～36μL加入到反应液中产生荧光反应。

8.如权利要求1-7任意一项所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于，所述待测样品的前处理步骤包括：剪取100mg小麦病叶叶片，将病叶的叶片置于液研钵中研磨得到组织材料，将所述组织材料固液分离得到植物组织材料，并95℃处理后，得到所需的待测样品。

9.如权利要求2-7任意一项所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述切口酶识别区域序列为5’-…GACTC…-3’或所述切口酶来源于重组大肠杆菌菌株；所述G-四链体合成模板序列包括5’-…CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCC…-3’。

10.如权利要求1-7任意一项所述的检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其特征在于：所述DNA分子机器的序列包括：5'-CCCCAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTGCATCGACTCGAAGCACGAAGCTTG-3’。