[发明专利]一种检测小麦矮缩病毒DNA的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其包括以下步骤：提供特异性识别待测小麦矮缩病毒DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G‑四链体合成模板的核苷酸序列；将所述DNA分子机器与待测样品相混合；提供DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA新链合成、形成单链切口和不断剥离产生富G基因片段的系列反应；提供硫黄素ThT诱导产生G‑四链体结构，并与G‑四链体结合产生荧光；检测和记录该荧光。本发明用于将样品中的小麦矮缩病毒DNA信号转化为G‑四链体，在常温下可实现G‑四链体的不断扩增，将小麦矮缩病毒DNA信高度放大，实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定。所述方法特异性强，无需使用价格昂贵或体积庞大的精密温控设备，便于进行快速检测和分析。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测小麦矮缩病毒DNA的方法。

背景技术

小麦矮缩病毒DNA(Wheatdwarfvirus,WDV)是联体病毒科玉米线条病毒属的成员,属于第I亚组联体病毒，小麦矮缩病毒DNA病,可造成小麦严重减产。目前小麦矮缩病毒DNA的检测采用PCR法检测。基于核酸扩增的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)已经成为国内外最常用的核酸分子检测方法，具有较高的特异性。但是，这类方法往往对操作人员有较高的要求并且需要专业的仪器设备，如价格昂贵的精密温控设备(用于核酸扩增以及体积庞大)、结构复杂的荧光检测系统(用于扩增产物的检测)，不利于现场、快速分析。

G-四链体(G-quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四链体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四链体通过π-π堆积形成四链体。

硫黄素T(ThioflavinT，ThT)是一种水溶性荧光染料，自身荧光信号很低，但在单链、双链或三链DNA/RNA与G-四链体同时存在时，硫黄素T(ThioflavinT，ThT)能够区分不同的核酸类型，对G-四链体具有很强的结构选择性，与G-四链体结合并产生更加稳定的荧光。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种检测小麦矮缩病毒DNA的方法，用于将样品中的小麦矮缩病毒DNA信号转化为G-四链体，在等温或常温下即可实现G-四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫黄素T结合G-四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种检测小麦矮缩病毒DNA的方法，其包括以下步骤：

S1：提供特异性识别小麦矮缩病毒DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为包括G-四链体互补序列的核苷酸序列；

S2：将所述DNA分子机器与待测样品相混合；

S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生，发生DNA新链合成、形成单链切口和不断剥离产生富G序列片段的系列反应；

S4：引入硫黄素T，诱导富G序列片段产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；

S5：记录荧光发光情况。

在本发明一个优选的实施方法中，所述的DNA分子机器从5’端到3’端依次是G-四链体合成模板、切口酶识别区、稳定区和靶序列识别区。

在本发明一个优选的实施方法中，所述靶序列识别区与小麦矮缩病毒DNA序列3’末端互补；所述的切口酶识别区为切口酶能够识别序列的互补序列；所述的G-四链体合成模板位于核苷酸序列的5’末端，G-四链体合成模板为G-四链体序列的互补序列。