[发明专利]一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法

权利要求书

1.一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)水稻外植体的获得：

挑取种皮完整且干燥的水稻成熟种子，在水中浸泡60-72小时，取出，再浸入体积浓度为5％-8％次氯酸钠水溶液中，放置15-18分钟，用无菌水漂洗2-4次；在容器中，铺无菌滤纸，将漂洗后的种子铺在无菌滤纸上，加入无菌水没过种子，于28-30℃培养36-48小时；挑选出带有1-2cm胚芽的水稻个体，用灭菌的手术刀在胚芽生长点处横切；

(2)农杆菌侵染液制备：

在超净工作台用移液枪吸取-80℃保存的含有目的基因Bar的农杆菌储存液200-300μL，加入到2-5mL灭菌的LB液体培养基中，置于25-28℃摇床中，150-200r/min，进行活化培养24-28h，得到活化的农杆菌菌液；吸取1-1.5mL活化的农杆菌菌液加入到25-30mL灭菌的LB液体培养基中进行扩大培养，至OD₆₀₀＝0.3-0.4的扩大培养的菌液，取25-30mL扩大培养的菌液置于灭菌的50mL离心管中，5000-8000r/min，25-28℃离心8-10min，收集菌体，将菌体重悬于50-100mL浓度为200-250μM乙酰丁香酮水溶液中，得到农杆菌侵染液；

(3)侵染转化与共培养：

用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，28-30℃培养；

(4)筛选，PCR检测：

长高至5-7cm后移栽至水田中生长，当小苗在水田中长出4-7片新叶，用浓度为150-180mg/L草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再PCR检测，鉴定得到成熟胚原位转基因阳性水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述生长基质为质量比3：2：1的营养土、蛭石和珍珠岩的混合物。