[发明专利]一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法

说明书

本发明公开了一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，包括如下步骤：(1)水稻外植体的获得；(2)农杆菌侵染液制备；(3)侵染转化与共培养：用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，培养；(4)筛选，PCR检测：长高至5‑7cm后移栽至水田中生长，当小苗在水田中长出4‑7片新叶，用浓度为150‑180mg/L草甘膦水溶液喷洒叶片，筛选出有抗性的水稻植株，再PCR检测，鉴定得到成熟胚原位转基因阳性水稻。本发明的方法简单、快速、高效，转化率可达4％。

技术领域

本发明属于植物基因工程育种领域，具体涉及一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是一年生禾本科植物，草本稻属的一种，也是稻属中作为粮食的最主要最悠久的一种。水稻是世界四大粮食作物之一，同时又是植物遗传学研究的重要模式植物之一。水稻的生产及其相关产业直接关系到国计民生。和我国其他农作物一样，水稻在种植生产过程中也面临着诸如农药污染严重、水资源短缺、土地盐碱化等一系列问题。近年来，水稻转基因技术在实现上述育种目标的进程中发挥着重要的作用。转基因技术是指利用现代分子生物学方法分离克隆目标性状基因，然后通过相应的转化手段将其导入到受体生物中并且能持续稳定遗传并表达，从而改良受体生物原有的性状或赋予其新的性状。

水稻遗传转化的主流方法为农杆菌介导的遗传转化法，其优点为操作简便、转化系统稳定、外源基因拷贝数较低等。l993-1994年，农杆菌介导的水稻遗传转化研究取得了重大突破，研究者首次通过农杆菌介导获得了转基因水稻植株。由于农杆菌介导的遗传转化方法主要是通过诱导愈伤的组织培养方法实现，而水稻组织培养的基因型依赖性很强，同时水稻组织培养再生体系仍普遍存在再生率低、重复性差、基因型依赖强、培养条件烦琐等问题，在很大程度上限制了利用基因工程手段对水稻的遗传改良。因此，亟需一种简便、高效的水稻遗传转化方法，这对水稻分子生物学研究和遗传改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有转化技术的不足，提供一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法，包括以下步骤：

(1)水稻外植体的获得：

挑取种皮完整且干燥的水稻成熟种子，在水中浸泡60-72小时，取出，再浸入体积浓度为5％-8％次氯酸钠水溶液中，放置15-18分钟，用无菌水漂洗2-4次；在容器中，铺无菌滤纸，将漂洗后的种子铺在无菌滤纸上，加入无菌水没过种子，于28-30℃培养36-48小时；挑选出带有1-2cm胚芽的水稻个体，用灭菌的手术刀在胚芽生长点处横切；

(2)农杆菌侵染液制备：

在超净工作台用移液枪吸取-80℃保存的含有目的基因Bar的农杆菌储存液200-300μL，加入到2-5mL灭菌的LB液体培养基中，置于25-28℃摇床中，150-200r/min，进行活化培养24-28h，得到活化的农杆菌菌液；吸取1-1.5mL活化的农杆菌菌液加入到25-30mL灭菌的LB液体培养基中进行扩大培养，至OD₆₀₀＝0.3-0.4的扩大培养的菌液，取25-30mL扩大培养的菌液置于灭菌的50mL离心管中，5000-8000r/min，25-28℃离心8-10min，收集菌体，将菌体重悬于50-100mL浓度为200-250μM乙酰丁香酮水溶液中，得到农杆菌侵染液；

(3)侵染转化与共培养：

用涂抹工具蘸取农杆菌侵染液，涂抹在步骤(1)的水稻胚芽生长点横切处，在穴盘中铺入配置好的生长基质，将涂抹后的水稻置于穴盘的生长基质上，再撒上一层生长基质，28-30℃培养；

(4)筛选，PCR检测：