[发明专利]一种体外诱导扩增高杀伤活性γδT细胞的方法

说明书

本发明涉及一种体外诱导扩增γδT细胞的方法，属于生物技术领域。该方法首先是通过淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞(PBMCs)，然后利用含有唑来膦酸、IL‑2、IL‑7和IL‑15的无血清培养基进行刺激培养3天；再用含有IL‑2、IL‑7和IL‑15的无血清培养基进行刺激扩增培养；当培养至7‑9天时候，加入尼克酰胺(Nicotinamide)以提高γδT细胞的抗肿瘤活性。本发明无需对PBMCs进行纯化，在培养14天即可获得纯度在90％以上的γδT细胞；尼克酰胺的加入，明显提高了γδT细胞的抗肿瘤活性。本发明可以将γδT细胞扩增1500倍以上，能够满足临床对γδT细胞数量的要求。本发明操作步骤简单，可操作性强，具有很好的推广价值。

技术领域

本发明涉及一种体外诱导扩增高杀伤活性γδT细胞的方法，属于生物技术领域。

背景技术

γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，是天然免疫的一种细胞类型,其TCR由γ和δ链组成。其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。γδT细胞所识别的抗原种类有限：①HSP；②感染细胞表面CD1分子提成的脂类抗原；③某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；④细菌裂解产物中的磷酸化抗原。此类T细胞主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，在外周血中只占CD3⁺T细胞的0.5％-1％，虽然在外周血T淋巴细胞的比较低，但是却是人体免疫防御第一道防线的重要组成部分。激活的γδT细胞能够分泌细胞因子和趋化因子，可以直接杀伤感染细胞或肿瘤细胞。

随着对肿瘤逃避免疫监视机理研究的不断深入，人们发现γδT细胞在抗感染和抗肿瘤方面发挥着重要的作用。肿瘤的过继免疫细胞治疗临床试验研究也表明：过继γδT细胞输注治疗肿瘤是安全的、也是有效的；γδT细胞的数量和抗肿瘤活性是过继γδT细胞输注治疗临床取得疗效的关键。因此，为了使过继γδT细胞治疗取得理想的临床治疗效果，需要获得大量具有高抗肿瘤活性的γδT细胞，以满足临床治疗的需要。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中如何才能扩增出大量具有高杀伤活力的γδT细胞的问题，提供一种体外诱导扩增高杀伤活力γδT细胞的方法。

技术方案

一种体外诱导扩增高杀伤活力γδT细胞的方法，包括如下步骤：

(1)制备PBMCs：取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞(PBMCs)，用PBS缓冲液重悬洗涤细胞两次；

(2)γδT细胞的刺激培养：向无血清培养基加入5-10v％的自体血浆，同时按照每毫升无血清培养基加1μLγδT细胞刺激因子的计量加入γδT细胞刺激因子，得到γδT细胞刺激培养基，使用γδT细胞刺激培养基悬起PBMCs，并调整密度至1-3×10⁶个细胞/mL，接种于培养瓶中，并置于37℃、5％CO₂的条件下培养；

(3)制备γδT细胞扩增培养基：按照每毫升培养基加1μLγδT细胞扩增因子的计量，向无血清培养基中加入γδT细胞扩增因子，得到γδT细胞扩增培养基；

(4)扩增培养：待步骤(2)中培养至第3d时，离心去除刺激培养基，使用γδT细胞扩增培养基将细胞密度调整到2-3×10⁶个细胞/mL，以后每2-3d根据细胞密度补液，直至培养至第7-9d，然后加入尼克酰胺(Nicotinamide)，使其在培养基中的终浓度为2.5-7.5mM，以后每2-3d补加γδT细胞扩增培养基使细胞密度保持在2-3×10⁶个细胞/mL，并补加尼克酰胺，使其在培养基中的终浓度为2.5-7.5mM；在37℃、5％CO₂的条件下培养10-14d，获得γδT细胞。

步骤(2)中，所述无血清培养基为本领域常规的无血清培养基，市售即可，比如X-VIVO15^TM，Optimizer的无血清T细胞培养基。