[发明专利]重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建方法及功能验证方法有效
| 申请号： | 201810872976.6 | 申请日： | 2018-08-02 |
| 公开（公告）号： | CN109053894B | 公开（公告）日： | 2021-09-24 |
| 发明（设计）人： | 辛洪波;陈廷涛 | 申请（专利权）人： | 南昌大学 |
| 主分类号： | C07K16/40 | 分类号： | C07K16/40;C12N1/21;C12Q1/02;C12R1/42 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 330031 江西省*** | 国省代码： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组 减毒鼠 伤寒 沙门氏菌 构建 方法 功能 验证 | ||
1.重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-GrB-Gala-VNP20009的构建方法，其特征是，所述构建方法包括如下步骤：
(1)获取GrB-Gala片段：以pET302-GrB-Gala为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列为引物，PCR扩增获得SEQ ID No.1所示的GrB-Gala片段；
(2)构建pcDNA3.3c-GrB-Gala重组质粒：将步骤(1)中获得的GrB-Gala片段，通过酶切酶连的方法连接到pcDNA3.3c其序列为：SEQ ID No.2的质粒中，重组质粒命名为pcDNA3.3c-GrB-Gala；
(3)构建pcDNA3.3c-GrB-Gala重组菌株：将步骤(2)中pcDNA3.3c-GrB-Gala重组质粒转入E.coli Top10中，获得重组菌株；
(4)构建pcDNA3.3c-GrB-Gala重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009：从步骤(3)中获得的重组菌株中获得重组质粒后，通过电转化的方法置于鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，电转条件：1800V、25uF、200Ω、4.7ms，将重组后的鼠伤寒沙门氏菌命名为pcDNA3.3c-GrB-Gala-VNP20009。
2.重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-GrB-Gala-VNP20009的功能验证方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1中的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-GrB-Gala-VNP20009，按照细胞与细菌100:1的比例，与B16F10细胞混合培养2小时后，换取含有青链霉素的新鲜培养基继续培养24h；
(2)将步骤(1)中培养的细胞，分别做拍照观察及采用MTT比色法计算该重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-GrB-Gala-VNP20009对细胞的特异性的杀伤作用。
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