[发明专利]重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建方法及功能验证方法

说明书

本发明公开了GrB重组单链抗体的构建及功能验证的方法：(1)构建pcDNA3.3c‑GrB‑Gala重组质粒；(2)构建pcDNA3.3c‑GrB‑Gala减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009重组菌株；(3)GrB重组质粒通过减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009胞内侵袭的特性,侵入细胞后实现蛋白GrB的真核表达，验证这种蛋白对细胞的杀伤作用。本发明中采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的胞内侵袭的特性实现人源毒素蛋白的表达，同时大量研究表明减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009能够特异性聚集在实体肿瘤中，可以实现特异性杀伤肿瘤细胞的目的，为肿瘤治疗研究提供实验依据。

技术领域

本发明属于生物制药、肿瘤医学领域，主要涉及GrB重组单链抗体的构建及功能验证的方法。

背景技术

颗粒酶(granzyme，Gr)是杀伤性T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞的颗粒中丝氨酸蛋白酶家族的总称。人的颗粒酶共有A、B、C三种类型，GrB最初以酶原的形式合成储存于CTL的颗粒中。CTL识别靶细胞时，GrB的N端酸性二肽被切除，成为活性形式。活性型GrB可通过穿孔素或受体进入靶细胞，切割含Asp-x，Gln-x位点的多种结构和功能蛋白，引起细胞凋亡。

本发明以减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009作为治疗载体，综合应用了减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性和特异性聚集在实体瘤中的性质，进一步扩大了本发明中肿瘤杀伤的特异性。

现今，在临床上对于癌症的治疗，提出了抗体药物偶联物(Antibody DrugConjugates，ADC)的一类新颖的治疗药物，本发明应用这一概念，结合实验前期基础，为ADC药物治疗的发展提供了一定的实验数据基础。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种真核质粒表达过程的减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的质粒转染技术。

本发明第二个目的是成功构建一株重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-GrBGala-VNP20009，具有特异性杀伤肿瘤细胞的效果。

GrB重组单链抗体的构建方法，包括如下步骤：

(1)获取GrB-Gala片段：以pET302-GrB-Gala为模板，以SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4序列为引物，PCR扩增获得SEQ ID No.1所示的GrB-Gala片段；

(2)构建pcDNA3.3c-GrB-Gala重组质粒：将步骤(1)中获得的GrB-Gala片段，通过酶切酶连的方法连接到pcDNA3.3c其序列为：SEQ ID No.2的质粒中，重组质粒命名为pcDNA3.3c-GrB-Gala；

(3)构建pcDNA3.3c-GrB-Gala重组菌株：将步骤(1)中pcDNA3.3c-GrB-Gala重组质粒转入E.coli Top10中，获得重组菌株；

(4)构建pcDNA3.3c-GrB-Gala重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009：从步骤(3)中获得的重组菌株中获得重组质粒后，通过电转化的方法置于鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，电转条件：1800V、25uF、200Ω、4.7ms，将重组后的鼠伤寒沙门氏菌命名为pcDNA3.3c-GrBGala-Gala-VNP20009。

所述的方法构建的一株重组减毒鼠伤寒沙门氏菌pcDNA3.3c-GrB-Gala-VNP20009。

所构建抗体功能验证方法包括如下步骤：

(1)将步骤1获得的这种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，按照细胞与细菌100:1的比例，与B16F10细胞混合培养2小时后，换取含有青链霉素的新鲜培养基继续培养24h。

(2)将步骤(1)中培养的细胞，分别做拍照观察及采用MTT比色法计算该蛋白对细胞的特异性的杀伤作用。