[发明专利]乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗细菌性阴道炎中的应用

权利要求书

1.乳酸乳球菌MG1363的构建，其特征在于,由以下步骤组成：

(1)pMG36e-CXCL12重组质粒构建:PstI-SPusp45-CXCL12-HindIII全序列化学合成获得pUC57-CXCL12重组质粒；

(2)构建pMG36e-CXCL12重组质粒：

A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57-CXCL12质粒；

B酶切：pMG36e，pUC57-CXCL12酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；

C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电泳45min；在276bp和3600bp左右切胶回收；

D酶连：酶连体系如下，总体系10μL，Fragment:Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；

E：转化由以下步骤组成:

a:从-80℃冰箱中取200μL MC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；

b:加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；

c:42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；

d:向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，离心4000rpm，1min，弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；

e:将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；

F:测序；

G:测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e-CXCL12，保存备用，步骤同上。

2.根据权利要求1所述的乳酸乳球菌MG1363的构建，其特征在于：将所制备的pMG36e-CXCL12通过电转化为乳酸乳球菌MG1363，转化过程由以下步骤组成：

A乳酸菌感受态制备：

a：取-80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363接种于5mL含有5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；

b:将获得菌液按照1％接种于含有2.5％Gly和5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD₆₀₀值为0.3-0.4，收集备用；

c:将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；

d:沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；

e:最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后即可使用；

B乳酸乳球菌MG1363电转化：

a:取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；

b:电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的含5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃培养2h，取100μL转化后产物涂布在含有红霉素抗性的含5％葡萄糖的M17平板上，30℃静置培养24-72h，筛选阳性克隆子。