[发明专利]乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗细菌性阴道炎中的应用

说明书

乳酸乳球菌MG1363的构建及其在治疗细菌性阴道炎中的应用。首先通过化学合成人源及鼠源趋化因子CXCL12，又称基质细胞衍生因子‑1(SDF‑1)，属于CXC类趋化因子家族的小分子蛋白。再加入乳酸乳球菌特有的分泌表达穿膜肽SPusp45,构建成pMG36e‑CXCL12重组质粒，之后电转进入乳酸乳球菌MG1363，实现趋化因子CXCL12的分泌表达。通过阴道栓塞给药的方式持续表达趋化因子CXCL12，以实现对细菌性阴道炎的缓解和治疗作用。

技术领域

本发明涉及乳酸乳球菌MG1363的制备方法及其在细菌性阴道炎中的应用，属于生物制药领域。

背景技术

趋化因子是一类对白细胞和干细胞具有定向趋化募集作用的小分子多肽类物质，它们的结构及功能相似，绝大多数在氨基酸序列上有4个保守的半胱氨酸，且根据其N端半胱氨酸的数量及间距的不同分为C-、CXC-、CC-及CX3C-4类趋化因子。趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，它有两种形式，SDF-1α/CXCL12a和SDF-1β/CXCL12b。CXCR4是趋化因子CXCLl2的特异性受体，属于G蛋白耦联的跨膜受体家族，与CXCLl2有高度的亲和力，它广泛表达在血液，免疫和中枢神经系统细胞。研究表明CXCL12/CXCR4效应轴主要参与缺血缺氧及损伤组织的修复，人类子宫内膜中CXCL12功能的研究表明：CXCL12可能在内膜增殖、胚胎着床中发挥重要作用，它们不仅能趋化白细胞以及修复细胞募集到创面，而且还能激活这些细胞，并增强它们的功能。因此我们设想可否通过CXCL12能够参与局部炎症反应和组织修复的性质来治疗细菌性阴道感染。但是，CXCL12在人体血液中极易被二肽氨肽酶IV(DPP IV)降解，且在严重组织损伤修复时产生的内源性CXCLl2水平不能满足组织修复的需要，因此有必要引入外源性CXCLl2。

本发明构建了pMG36e-CXCL12重组表达载体，采用乳酸乳球菌MG1363作为表达菌株。乳酸乳球菌属于公认的益生菌，对人体有良好的益生作用，同时乳酸菌良好的耐酸、产酸特性，为重组菌株在阴道中发挥作用提供了基本条件，并且乳酸乳球菌在人体阴道中可以实现CXCL12持续不断地表达，乳酸菌产酸及阴道的酸性内环境均可抑制DPP IV的生物活性，从而提高CXCL12的生物利用度以达到治疗细菌性阴道感染功效。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种分泌表达趋化因子CXCL12的乳酸乳球菌MG1363的制备方法及其在治疗细菌性阴道感染中的应用，建立了一种CXCL12乳酸乳球菌表达系统，通过乳酸乳球菌在阴道内持续分泌表达CXCL12，参与局部炎症反应和组织修复，从而实现对细菌性阴道感染的治疗作用；

本发明是通过以下技术步骤实现的：

乳酸乳球菌MG1363的构建,由以下步骤组成：

(1)pMG36e-CXCL12重组质粒构建:PstI-SPusp45-CXCL12-HindIII全序列化学合成获得pUC57-CXCL12重组质粒；

(2)构建pMG36e-CXCL12重组质粒：

A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57-CXCL12质粒；

B酶切：pMG36e，pUC57-CXCL12酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；

C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电泳45min；在276bp和3600bp左右切胶回收；

D酶连：酶连体系如下，总体系10μL，Fragment:Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；

E：转化由以下步骤组成: