[发明专利]靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白，其特征是：

(1)通过人工合成的方法直接获得GIP34-VP3融合蛋白基因片段，其完整核酸序列为SEQ ID No: 1，SEQ ID No: 1序列由下列三个基因片段构成：人GIP34 基因片段、序列为SEQ ID No: 2；链接片段基因、序列为SEQ ID No: 3；VP3基因片段、序列为SEQ ID No: 4；

(2) 此GIP34-VP3融合蛋白的完整氨基酸序列为序列SEQ ID No: 5，该序列由下列3个氨基酸片段构成：GIP34的氨基酸片段、序列为SEQ ID No: 6；链接片段氨基酸、序列为SEQID No: 7；VP3氨基酸片段、序列为SQE ID No: 8。

2.按照权利要求1所述的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白，其特征是：所述GIP34-VP3融合蛋白基因片段亚克隆到哺乳细胞表达载体及在哺乳细胞中表达。

3.制备权利要求2所述的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白的方法，其特征是：

（1）GIP34-VP3融合蛋白哺乳细胞株的构建、发酵及回收 将人工合成的基因片段“GIP34-linker-VP3”亚克隆到哺乳细胞表达载体，转染哺乳细胞株表达，筛选高效表达细胞株，表达GIP34-VP3融合蛋白；

（2）GIP34-VP3融合蛋白的纯化 取高效表达细胞株细胞培养上清，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后4℃放置6小时以上，4℃下10000g离心30min 收集沉淀，沉淀用100ml平衡液溶解，并对平衡液5000ml平衡液透析24小时以上，中间换夜2次；样品再上用平衡液平衡好的阴离子层析柱或-20℃ 保存备用，分别用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L和1mol/LNaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，SDS电泳鉴定，取含分子量17.6kD蛋白质部分；用平衡液平衡Separose12层析柱；将上述浓缩的18kD蛋白质部分按床体积的2-5%比例上样，流速为1.5ml/min；分步收集；SDS电泳鉴定后，收集分子量为17.6kD纯度高的蛋白质部分即为GIP34-VP3融合蛋白；

(3) 纯化的GIP34-VP3融合蛋白鉴定 采用SDS电泳法或高效液相法测定蛋白质纯度，纯度在97%以上,分子量为17.6kD，采用紫外分光光度计测定蛋白质含量，为0.3mg/ml。

4.权利要求1或2所述的一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白在制备用于抗恶性肿瘤治疗的药物中的用途。