[发明专利]靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的GIP34-VP3融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种靶向特异性诱导肿瘤细胞，特别是肝癌细胞凋亡的重组GIP34‑VP3融合蛋白及其制备方法、用途，其要点是：通过人工合成方法直接合成GIP34‑VP3基因片段，将GIP34‑VP3基因片段亚克隆到真核载体并转染哺乳细胞株，表达重GIP34‑VP3融合蛋白；此GIP34‑VP3融合蛋白具有有很强的靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡作用，可用于恶性肿瘤的治疗。

技术领域

本发明涉及一种靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的融合蛋白，特别是靶向特异性诱导肝癌细胞凋亡的融合蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

原发性肝细胞癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，以起病隐匿，生长迅速，术后复发，预后极差为特点。据统计全世界每年新发肝癌患者60万例，而我国的肝癌新发患者数占全球的一半以上，肝癌已经成为国人健康和生命的第一杀手。目前，手术切除是肝癌治疗的首选方法，但绝大多数肝癌患者就诊时已到中晚期，丧失了手术治疗的良机，而常规的放、化疗效果极差，患者生存期一般不超过6个月。所以，建立肝癌精准靶向治疗的方法具有巨大的社会意义。

在肝癌患者中约80％的患者血清中可以检测到甲胎蛋白(alpha- fetoprotein,AFP)升高，AFP的含量与肝癌的恶性程度、药物耐受、患者预后及生存率等密切相关。过去一直认为AFP通过与癌细胞表面的AFP受体结合，是促进肝癌细胞生长的重要细胞因子，但是AFP是一种结构复杂的蛋白质，有 3个不同的功能区，每个功能区有不同的生物学作用。最近研究表明来源于AFP 的小分子多肽如GIP34、GIP14、GIP12、GIP8具有明确的抑制癌细胞生长作用，特别是GIP34通过P53和Bcl-2抑制肿瘤细胞的生长，业已成为癌症精准靶向治疗的新靶点。研究表明GIP34具有穿透肽和阻断离子通道的双重作用。GIP34 通过破坏所有癌细胞所具有的网状负电脂质双层而穿入到细胞质膜中，进而诱发癌细胞凋亡。癌细胞表面带有的网状负电不仅是靶向凋亡的标记，也使其成为GIP34指定穿入的候选细胞，所以GIP34靶向结合带有网状负电的癌细胞，而不结合带有正电的正常细胞，为其靶向特异性诱导癌细胞凋亡提供了理论基础。

国内外研究证明鸡贫血病毒VP3蛋白对人的各种组织来源的肿瘤细胞和异常转化细胞具有特异性杀伤作用，被命名为肿瘤特异性凋亡因子(Apoptin)，有希望成为有效治疗癌症的新型生物制剂。但是由于种属间的差异，人体细胞膜表面没有VP3相关的蛋白受体，所以，VP3不能与人的所用细胞主动结合，包括肿瘤细胞。而VP3必须进入肿瘤细胞，才能引起肿瘤细胞凋亡。所以限制了VP3的应用。此外VP3不是鸡贫血病毒的结构蛋白质，在体外非常不稳定，限制规模化生产。

为解决上述理论问题，我们曾经将VP3与GST融合表达，获得了体外稳定批量获得VP3蛋白的技术(专利号：ZL201010107675.8)，解决了体外大量获得 VP3蛋白的技术难题；同时我们将叶酸通过化学方法联结到VP3蛋白上，使其能自主进入肿瘤细胞，解决了种属间差异造成的VP3不能自主进入人肿瘤细胞的理论问题(专利号：ZL201010107682.8)。VP3诱导细胞凋亡的原理是必须进入癌细胞才能发挥作用；VP3诱导肿瘤细胞凋亡的特点是不依赖于抑癌基因-53 作用途径，也不被抑制细胞凋亡基因(Bcl-2)过量表达所抑制，而是激活与细胞凋亡相关的酶(主要为caspase)引起细胞凋亡。

在解决这两个技术难题的基础上，我们又对VP3进行了进一步的改进，将 GIP34与VP3基因融合，制备出能靶向特异性诱导肝癌细胞凋亡的GIP34-VP3 的融合蛋白。此融合蛋白即发挥了GIP34能与肝癌细胞靶向结合并抑制其生长的作用，又发挥了VP3特异性诱导肝癌细胞凋亡的双重药理效果，为肝癌治疗提供一个全新的基因工程产品。

发明内容

本发明提供一种在真核细胞中高效表达、稳定好、纯度高、且能靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组蛋白及其制备方法，及该方法获得的制品在抗肿瘤治疗中的应用。本发明提供的GIP34-VP3融合蛋白能与肿瘤细胞发生特异性结合、穿入细胞膜进入胞浆并特异性诱导肿瘤细胞凋亡，以达靶向特异性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，可满足临床治疗肿瘤的需要。