[发明专利]基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针及其试剂盒与方法

权利要求书

1.一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：

FP：5’-TCGCCTTGGCCGTAATTCTA-3’；

BP：5’-ACGTAAGCCTTTTCTGTTGTAACATC-3’；

Probe：5’-FAM-AAATGATGCAGGATGGG-BHQ1-3’，其中5端标记的荧光基团是FAM，3端标记的淬灭基团是BHQ1。

2.如权利要求1所述的基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针，其特征在于：扩增反应时，FP引物、BP引物和探针的摩尔比为9：9：2。

3.一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，试剂盒包含权利要求1或2中所述的引物和探针。

4.如权利要求3所述的基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)2×ddPCR Supermix；(2)无RNA酶的超纯水；(3)阳性对照和阴性对照；(4)细菌总DNA提取试剂。

5.如权利要求4所述的基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于：所述的2×ddPCR Supermix含有：2×PCR Buffer，2×Taq DNA Polymerase，36μM FP引物和BP引物，20μM探针，400μM dNTP mix和2×RNase Cocktail(ThermoFisher)。

6.如权利5所述的基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于：所述的2×PCR Buffer含有20mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mM MgCl₂，20mM KCl和2mg/mL BSA。

7.如权利要求4所述的基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒，其特征在于：阳性对照为副猪嗜血杆菌DNA，阴性对照为去离子水。

8.一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细菌DNA的提取

1)取待检样品1g，加入600μL裂解液A研磨后，涡旋混匀20秒，室温静置10分钟；

2)将混合液移至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；

3)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液B至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；

4)丢弃收集管中液体，加入500μL洗液C至吸附柱中，12,000×g离心30～60秒；

5)丢弃收集管中液体，12,000×g离心2分钟以甩干柱子；

6)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，向柱子中央加入洗脱液50μL，室温静置2分钟，12,000×g离心1分钟，离心管中液体即为模板DNA；

(2)数字PCR操作

1)待检样品、阴性对照和阳性对照每个反应管各加入数字PCR反应液19μL；分别取1μL模板DNA，加入相应的反应管中，配置成20μL数字PCR反应体系；所述模板DNA包括待检样品、阴性对照和阳性对照；

2)将20μL样品反应液加入到微滴发生卡内，制备微滴；

3)将微滴转入PCR板中，放入PCR仪中进行扩增；

4)将扩增完成的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴中的荧光信号，分析数据，显示检测结果；

5)结果判定及描述：阳性对照：40±2个拷贝，阴性对照：＜1个拷贝时，实验结果成立；待检测样品结果≥1个拷贝时为阳性；待检测样品结果＜1个拷贝时为阴性。

9.如权利要求8所述的基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法，其特征在于：所述(2)中数字PCR反应液19μL含有2×ddPCR Supermix 10μL和超纯水9μL，加入1μL模板后构成20μL数字PCR反应体系。

10.如权利要求8所述的基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法，其特征在于：扩增程序为：60℃反应30min；95℃反应5min；94℃反应30sec，60℃反应60sec，40个循环；98℃反应10min；每步都设置2.5℃/sec的升降温速度。