[发明专利]基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针及其试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针及其试剂盒与方法。引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe；检测试剂盒包括2×ddPCR Supermix、无RNA酶的超纯水、细菌总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，利用微滴数字PCR技术对待检样品DNA进行定量检测，通过扩增分析得到的拷贝数判断待检样品是否含有副猪嗜血杆菌，并测定其含量。本发明具有精准、灵敏、适用性广，无需依赖标准曲线，可实现绝对定量等优点，可实现副猪嗜血杆菌病诊断的早发现、早治疗和早预防，能有效控制疫情爆发。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针及其试剂盒与方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌。在一定条件下可引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征，该病原引起的疾病又称为格氏病。副猪嗜血杆菌有15个以上血清型，血清1、5、10、12、13和14型是引发猪发病和死亡的强毒血清型；血清型2、4和15是可引起多发性浆膜炎的中等独立型；血清型8属于弱毒力型，血清型3、6、7、9和11为不引起临床症状的无毒力型，我国以血清4和5型流行最多。副猪嗜血杆菌病死亡率较高，病发后不易治愈，病死率高达50％。该病传染性强，且多与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康。该病在我国已呈现出流行趋势，给养猪业带来了巨大的经济损失。为此，建立早期快速检测方法对副猪嗜血杆菌感染的预防和控制具有十分重要的意义。

目前，实验室常用的检测副猪嗜血杆菌的方法有细菌分离、血清学诊断技术(补体结合试验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统的细菌分离和血清学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。PCR操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。

数字PCR(digital PCR，dPCR)是近十年来兴起的第三代PCR技术，其原理是将预混的PCR反应体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过PCR扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。与实时荧光PCR相比，该方法具有精准、灵敏度超高和不易受PCR抑制物影响等优点。而现有技术并没有利用数字PCR技术针对副猪嗜血杆菌进行绝对定量检测的相关研究以及是否可行的相关方案及适合产业化的成品试剂盒。因此，开发相关利用数字PCR技术对副猪嗜血杆菌进行检测的方法和试剂是业界亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的试剂盒。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种基于数字PCR技术检测副猪嗜血杆菌的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：

FP：5’-TCGCCTTGGCCGTAATTCTA-3’(SEQ ID NO：1)；

BP：5’-ACGTAAGCCTTTTCTGTTGTAACATC-3’(SEQ ID NO：2)；