[发明专利]联合免疫效果早期快速评价方法中的试剂及其应用

说明书

本发明公开了一种改良型溶血素，该溶血素由皂角苷、多聚甲醛、Triton X‑100配制而成。在重症ACLF患者中，本发明的改良型溶血素溶血后单核细胞的比例明显高于BD Lysing^TM solution溶血的比例，表明本发明的改良型溶血素对单核细胞损伤要小于BD Lysing^TM solution，能够获得更高比例的单核细胞，更加有利于单核细胞的研究。

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及联合免疫效果早期快速评价方法中的试剂及其应用。

背景技术

流式细胞仪已应用于科学研究和医学临床检验的各个领域，如免疫功能的检查，肿瘤抗原，转移基因与抑癌基因及其他疾病相关基因的检测，细胞凋亡，艾滋病诊断与预后判断等。流式细胞术(flow cytometry，FCM)可以对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，是当代生命科学领域中先进技术之一，在基础研究及临床检测等领域得到广泛应用。

白细胞分群和计数是医学诊断中分析人体血液的重要指标。血液中的白细胞有五种类型，淋巴细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，后三种统称为粒细胞，因此将白细胞分为三个亚群，即为淋巴细胞，单核细胞，粒细胞。

有效分离出比例高的单核细胞是联合免疫效果早期快速评价方法中的重要环节。因为生物恐怖剂感染来势凶险、病原复杂，基于单一免疫制剂的免疫方案往往不能发挥有效的防护作用，急需研发新的联合免疫技术。为了应对生物恐怖剂和战剂的威胁，美国在20世纪80年代生物防恐部门颁布了《联合免疫条令》，重点发展包括联合疫苗、广谱药物在内的联合对抗措施。目前我国还没有成熟的生物恐怖剂的联合疫苗或联合免疫方案。因为联合免疫存在很多不确定性，各个成员间免疫应答是促进还是抑制，干扰程度如何，已经被感染后二重感染效率等都会影响联合免疫的效果。此外，在需要应急联合免疫的情况下，制定合理的联合免疫方案后，如何快速、高通量评价联合免疫的效果，是一个亟待解决的难题。现有的免疫效果评价标准包括中和抗体的水平以及细胞免疫反应尤其是CD8+T细胞(Tcytotoxic T cells，Tc)反应的强弱两个方面。但从免疫到检测抗体等的产生需要10天以上的时间，此检测方法不利于应急联合免疫情况下的效果评价，需要新的评价方法及技术在免疫初期即可判断联合免疫效果。本领域技术人员可知，天然免疫细胞中的巨噬细胞在病原微生物早期的吞噬、清除中发挥关键作用，巨噬细胞可分化为促进抗感染应答的M1型，以及抑制免疫应答的M2型。文献报道及研究发现巨噬细胞表型与后期的细胞免疫应答能力相关，及M1表型导致强的抗感染免疫应答，而M2表型意味着低的抗感染细胞免疫应答，从而提示可以通过早期分析巨噬细胞表型快速判断疫苗的联合免疫效果。巨噬细胞是由单核细胞诱导而成，为了在体外研究是否可以通过研究巨噬细胞表型以实现快速判断疫苗联合免疫效果的目的，需要获取大量的单核细胞，这就需要对血液中的白细胞进行高效分离。

溶血素是白细胞计数或白细胞分类的关键试剂，属于临床检验最常用的试剂之一，与稀释液等配套用于血细胞分析仪(如流式细胞仪)中。白细胞分类计数需要稀释血液样本，并且需要特异的溶血素，一方面，溶血素使红细胞(RBC)迅速溶解，溶解红细胞后进行白细胞计数，以免干扰白细胞的检测(因为血液中的红细胞数量远远多于白细胞数量)。另一方面，为了保证白细胞三个亚群的检测，白细胞的体积也需要一定程度的改变，此时的白细胞膜需要一定程度的溶解，以便释放出胞浆，同时维持细胞核的完整状态，保持一定体积以便进行分群测定。

在血样品处理中，溶血素对外周血的细胞分群会产生明显的影响，不同的溶血素对不同疾病的实验结果有着显著的影响。目前，流式细胞仪所用溶血素基本依靠进口，并且不能及时供应，给使用者带来很大的不便和浪费。

发明内容