[发明专利]一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用

权利要求书

1.一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法，其特征在于：

包括由温敏基因敲除质粒、及温敏基因敲入质粒介导的基因敲除及敲入，以及由FLP/FRT系统介导的抗性回收；

所述由温敏基因敲除质粒、及温敏基因敲入质粒介导的基因敲除及敲入是指：温敏基因敲除及敲入质粒转化至地衣芽孢杆菌中，之后通过变温传代过程实现敲除盒及敲入盒同源替换靶基因，得到基因敲除菌株及基因敲入菌株；

所述由FLP/FRT系统介导的抗性回收是指：首先构建FLP重组酶表达质粒；构建的重组酶表达质粒转化至地衣芽孢杆菌的基因敲除菌株及基因敲入菌株中；质粒表达的FLP重组酶特异性识别FRT位点并介导2个FRT位点之间的抗性基因表达盒的删除；

所述温敏基因敲除质粒是在温敏质粒PNZT1的基础上，插入卡那霉素抗性基因表达盒以及敲除盒；

所述敲除盒按照基因敲除靶基因的方向依次包括以下核心元件：基因敲除靶基因上游同源臂、FRT位点、卡那霉素抗性基因表达盒、FRT位点、基因敲除靶基因下游同源臂；

所述温敏基因敲入质粒是在温敏质粒PNZT1的基础上，插入四环素抗性基因表达盒以及敲入盒；

所述敲入盒按照基因敲入靶基因的方向依次包括以下核心元件：基因敲入靶基因上游同源臂、vgb基因表达盒、FRT位点、四环素抗性基因表达盒、FRT位点、基因敲入靶基因下游同源臂；

所述基因敲除及敲入的具体步骤如下：

(1)把构建好的温敏基因敲除及敲入质粒通过电转的方法转入地衣芽孢杆菌细胞中，提质粒酶切验证；

(2)转化成功的含敲除及敲入质粒的转化子首先在30℃、200rpm下增值活化2代，形成足够的新鲜菌液；

(3)转接2％的菌液至15mL LB培养基，42℃、250rpm无抗传代2次；

(4)转接2％的步骤(3)得到的菌液至新的15mL LB培养基，30℃、200rpm无抗传代2次；

(5)最后用接菌环蘸取菌液在敲除盒及敲入盒抗性平板上划线挑菌落，平板置于37℃培养箱培养，12-20h长出单菌落，菌落PCR筛选得到双交换重组子；

FLP/FRT系统介导的抗性回收方法如下：转化FLP重组酶表达质粒，抗性回收时培养温度是30℃，抗性回收后培养温度提高至37℃无抗培养2代可消除质粒；

所述温敏质粒PNZT1是一种大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒，含有温度敏感性复制子，在30℃及以下可稳定复制，37℃及以上丢失；

所述温敏质粒PNZT1序列如SEQ ID NO：8所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述FLP重组酶表达质粒构建方法如下：

(1)flp结构基因克隆自大肠杆菌质粒PCP20，NdeI和BamHI酶切后连接至大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PMA5；

(2)从PMA5上克隆出携带HpaII启动子的FLP重组酶表达盒，连接到温敏质粒PNZTT上得到基因敲除消抗质粒PNZTT-flp，连接到温敏质粒PNZTK上得到基因敲入消抗质粒PNZTK-flp。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述基因敲除靶基因是α-淀粉酶基因amyL，该基因序列如SEQ ID NO：1所示；

所述FRT位点序列如SEQ ID NO：2所示；

所述FLP重组酶表达盒序列如SEQ ID NO：3所示；

所述基因敲入是指整合外源透明颤菌血红蛋白基因vgb到基因组的同时敲除pflB基因，pflB基因编码丙酮酸甲酸裂解酶，pflb基因序列如SEQ ID NO：4所示，vgb表达盒序列P43-vgb如SEQ ID NO：5所示；

所述卡那霉素抗性基因表达盒序列如SEQ ID NO：6所示；

所述四环素抗性基因表达盒序列如SEQ ID NO：7所示。