[发明专利]一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用

说明书

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用，实现了基因敲除及基因敲入，属于基因工程领域。该方法首先借助温度敏感型质粒PNZT1为载体构建温敏敲除(入)质粒；然后将敲除(入)质粒转化地衣芽孢杆菌经过变温传代实现敲除(入)盒同源替换靶基因；最后导入FLP重组酶表达质粒介导抗性基因的回收。本发明首次在地衣芽孢杆菌基因编辑中运用FLP/FRT重组系统并实现了无标记基因敲除及基因敲入，为地衣芽孢杆菌的代谢工程改造提供了有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用。

背景技术

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，简称BL)是一种常见的革兰氏阳性细菌，具有耐热、酶系丰富、产酶量高和安全等诸多优良特性，是最具应用潜力和价值的芽孢杆菌之一。不同于绝大多数芽孢杆菌在生长过程中严格需氧，地衣芽孢杆菌属兼性厌氧菌，所以对生长和发酵条件的适应性更强。目前地衣芽孢杆菌被广泛用于蛋白质的胞外表达，产物包括α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、青霉素酶等，最高产量可达25g/L。地衣芽孢杆菌也被用于生产多肽类抗生素(如杆菌肽)、有机酸、高分子聚合物(如多聚谷氨酸)等产品，对现代工业生产具有重要意义。

当前以基因组序列信息为蓝图，基于人工设计的遗传扰动而进行的代谢工程已成为研究地衣芽孢杆菌复杂的代谢途径以及进行菌种改造构建需要表型的最有效策略。然而由于地衣芽孢杆菌遗传转化效率不高，几乎无法形成感受态(刘冰南.地衣芽孢杆菌转化薯渣与汁水效能及其代谢机理研究[D].哈尔滨工业大学,2015.)，导致其基因敲除存在一定困难，相关成功运用的例子也较少。

传统的转化敲除盒片段替换靶基因的方法是实现微生物基因敲除的经典策略，主要通过微生物本身的RecA重组系统(主要包括RecA和RecBCD等蛋白)发挥作用。但是受限于地衣芽孢杆菌遗传转化效率不高，且线性DNA在菌体内受到限制修饰系统的降解，导致该方法的阳性转化率很低，而且该方法还面临无法进行抗性标记回收问题。

华中农业大学的陈守文团队(Li K,Cai D,Wang Z,et al.Development of anEfficient Genome Editing Tool in Bacillus licheniformis Using CRISPR-Cas9Nickase.[J].Appl Environ Microbiol,2018,84(6):AEM.02608-17.)把近年来发现的CRISPR/Cas9系统运用到地衣芽孢杆菌中，实现了单基因敲除、双基因同时敲除以及片段整合等操作。虽然该方法的敲除效率较高，但是缺陷在于Cas9基因分子量过大，而且地衣芽孢杆菌不具备非同源末端结合功能(non-homologous end joining，NHEJ)，因此需要额外的同源修复片段(homology directed repair，HDR)，导致构建的敲除质粒过大(大于10Kbp)使得难以转化。另外CRISPR/Cas9系统还存在普遍的脱靶效应。

目前比较成功的地衣芽孢杆菌基因敲除策略是采用以温敏质粒为载体的同源双交换法，即获取目的基因上下游两段基因序列作为同源臂，构建穿梭载体或自杀载体并转化到目的菌株中，通过同源双交换实现靶基因的敲除。德国的Nahrstedt等人(NahrstedtH,Waldeck J,M,et al.Strain development in Bacillus licheniformis:Construction of biologically contained mutants deficient in sporulation andDNA repair[J].Journal of Biotechnology,2005,119(3):245-254.)通过使用温度敏感型质粒pE194为载体构建敲除质粒敲除了地衣芽孢杆菌DNA修复相关基因recA和芽孢形成关键基因spoIV。该方法的优点是可以克服地衣芽孢杆菌遗传转化效率低的问题，缺点是由于敲除盒上没有设计筛选标记，会造成筛选工作量极大，进而导致敲除效率非常低。