[发明专利]液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒的应用，其特征在于，

采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的干血片/血清/血浆中33种氨基酸，先利用高效液相色谱将33种氨基酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述33种氨基酸的含量；

其中检测的氨基酸包括：γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸和高脯氨酸；

该液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒包括如下试剂：

①混合内标物：L-丙氨酸-D₄、L-苯丙氨酸-C₁₃、L-亮氨酸-D₃、L-缬氨酸-D₈、L-精氨酸-C₁₃,D4、L-瓜氨酸-D₂、DL-谷氨酸-D₃、L-酪氨酸-¹³C₆、L-鸟氨酸-D₂:HCl、L-甲硫氨酸-D₃、L-天门冬氨酸-D₃、甘氨酸-¹³C,¹⁵N、氨基丁酸-D₃、天冬酰胺-D₃、羟脯氨酸-D₃、赖氨酸-D₉、脯氨酸-D₇、丝氨酸-D₃和色氨酸-D₅；

②标准品：含：γ-氨基丁酸、DL-2-氨基己二酸、肌氨酸、6-氨基己酸、同型精氨酸、β-丙氨酸、3-甲基-L型组氨酸、天冬氨酸、L-甲硫氨酸、羟基脯氨酸、L-2-氨基丁酸、天门冬酰胺、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、L-酪氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、组氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、DL-3-氨基异丁酸、犬尿氨酸、瓜氨酸、1-甲基-L型组氨酸和高脯氨酸；

③洗脱液：

洗脱液A：10mM甲酸铵+0.1％甲酸水溶液

洗脱液B：0.1％甲酸乙腈溶液；

④衍生化试剂：

正丁醇+乙酰氯；

⑤稀释剂：

稀释剂：甲醇溶液；

⑥质控品：

高质控品以及低质控品，其中高质控品为添加有33种氨基酸的血浆，低质控品为正常人的混合血浆；

当检测样本为干血片中的氨基酸时，打孔器进行干血片打孔，置于干净的离心管中，每个孔中只放1个血斑，使用多通道或单通道移液枪以反向加液法向每孔中加入体积比为1:1的混合内标液和甲醇溶液，涡旋震荡，置于离心机，高速离心，取出一定体积的上清液转移到孔板中；

当检测样本为血浆或血清中的氨基酸时，使用单通道移液枪取样于离心管，加入氨基酸混合内标，其中所述样本和氨基酸混合内标的体积比为1:15.6，涡旋震荡，置于离心机，高速离心，使用单通道移液枪，取出上清液转移到孔板，

样品的预处理过程如下：使用氮吹仪，50℃加热，打开氮气流量阀至0.06-0.09MPa，15-18min氮气吹干；使用多通道移液枪加入衍生化试剂至孔板，粘性封膜密封，60℃振荡孵育30min；孵育完成后取下微孔板，静置1min，揭掉板垫，使用氮吹仪，50℃加热，打开氮气流量阀至0.07MPa，15-20min氮气吹干；使用多通道移液枪加入超纯水至孔板，封板垫密封，室温振荡孵育；孵育完成后，把微孔板放入到Waters Xevo TQD样品管理器中，上样检测。

2.根据权利要求1所述的一种液相色谱串联质谱法同时检测多种氨基酸的试剂盒的应用，在液相色谱串联质谱检测中，离子源为电喷雾电离离子源；毛细管电压3.0kV；去溶剂气温度400℃；去溶剂气流速800L·h-1；锥孔反吹气流速50L·h-1；源温度150℃；去溶剂气和锥孔反吹气为氮气；碰撞气为氩气；扫描方式为多重反应离子监测，各氨基酸的质谱参数为：