[发明专利]新型脯氨酸4-羟化酶及其应用

权利要求书

1.一种改造脯氨酸4-羟化酶的方法，使得改造后的具有脯氨酸4-羟化酶功能的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3、4、5、6、7、8、9、12所示。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，待改造的具有脯氨酸4-羟化酶功能的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 11所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改造后的具有脯氨酸4-羟化酶功能的多肽的热稳定性提高。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测所得具有脯氨酸4-羟化酶功能的多肽的活性或热稳定性的步骤。

5. 一种脯氨酸4-羟化酶，所述脯氨酸4-羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3、4、5、6、7、8、9、12所示。

6. 一种多肽在生产反式-4-羟基-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物中的用途，所述多肽是：

1) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的多肽；或者

2) 权利要求5所述的脯氨酸4-羟化酶。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物是碳青霉烯类抗生素侧链。

8. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包含以下多肽的编码基因：

1) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的多肽；或者

2) 权利要求5所述的脯氨酸4-羟化酶；

所述宿主细胞是细菌。

9. 如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自：大肠杆菌(E. coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

10. 一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物的方法，所述方法包括：

1) 培养权利要求8或9所述的宿主细胞，和

2) 任选从1)的培养体系中分离产生的反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物；

或者，所述方法包括：

1) 利用以下多肽催化L-脯氨酸生产反式-4-羟基-L-脯氨酸：

a. 氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的多肽；或者

b. 权利要求5所述的脯氨酸4-羟化酶；和

2) 任选从1)的催化体系中分离获得的反式-4-羟基-L-脯氨酸。

11. 一种反式-4-羟基-L-脯氨酸或以反式-4-羟基-L-脯氨酸为前体的下游产物的生产菌株的构建方法，所述方法包括使得所述菌株包含以下多肽，所述多肽是：

a. 氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的多肽；或者

b. 权利要求5所述的脯氨酸4-羟化酶。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述菌株是细菌。

13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述菌株选自：大肠杆菌(E. coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。