[发明专利]新型脯氨酸4-羟化酶及其应用

说明书

本发明公开了一种改造脯氨酸4‑羟化酶的方法，该方法通过在待改造脯氨酸4‑羟化酶的特定位点之间的区段进行整体替换，和/或在特定位点进行氨基酸突变能显著提高所得脯氨酸4‑羟化酶的活性和热稳定性，从而得到稳定性和活性优异的脯氨酸4‑羟化酶。本发明的脯氨酸4‑羟化酶可以应用于生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸或以反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸为前体的下游产物。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及新型的脯氨酸4-羟化酶、其编码基因和包含该酶或其编码基因的宿主细胞以及它们在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(简称羟脯氨酸)，是一种具有独特生理活性的氨基酸，易溶于水，广泛应用于医药、化工、动物饲料和美容业等领域，市场前景广阔。由于价格昂贵羟脯氨酸目前主要用于合成碳青霉烯类抗生素(美罗培南等)的侧链。碳青霉烯类是第三代抗生素，是抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，全球总体市场已超过了30亿美元。

反式-4-羟基-L-脯氨酸可以通过脯氨酸4-羟化酶催化L-脯氨酸羟基化来生产，目前用于生产L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)等，但是这些菌株都没有编码脯氨酸4-羟化酶的基因。因此，挖掘能够在L-脯氨酸生产菌中表达并具有高效催化活性的脯氨酸4-羟化酶是实现反式-4-羟基-L-脯氨酸工业生产的关键。

然而，目前报道的已经工业应用的脯氨酸4-羟化酶只有来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶。指孢囊菌属于放线菌，是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌，GC含量为74％，并且含有大肠杆菌等宿主的稀有密码子。因此，指孢囊菌的野生型脯氨酸4-羟化酶在原核生物，例如大肠杆菌中重组表达时主要以没有活性或活性很低的包涵体形式存在，经过密码子优化后的突变型孢囊菌来源的脯氨酸4-羟化酶在表达量和催化性能上依然较差。

因此，本领域急需具备表达量和催化性能较好的脯氨酸4-羟化酶，从而有助于提升生物法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的脯氨酸4-羟化酶，一种改造脯氨酸4-羟化酶的方法，一种稳定性和活性改善的脯氨酸4-羟化酶以及其在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸上的应用。

在第一方面，本发明提供一种改造脯氨酸4-羟化酶的方法，所述方法包括：

1)检索所述待改造的具有脯氨酸4-羟化酶功能的多肽的氨基酸序列；

如果在所述待改造多肽的氨基酸序列中145-146位的氨基酸残基是N、G，182位的氨基酸残基是D或R或S；或者，如果所述待改造脯氨酸4-羟化酶的氨基酸序列中对应于SEQID NO:2的145-146位的氨基酸残基是N、G，对应于SEQ ID NO:2的182位的氨基酸残基是D或R或S；

则将上述氨基酸残基G之后的第16位到上述氨基酸残基D或R或S之前的第4位之间的氨基酸区段替换为SEQ ID NO:13所示氨基酸序列，从而得到改造后的具有脯氨酸4-羟化酶功能的多肽；

或者

2)将所述待改造多肽的氨基酸序列中第90位的氨基酸残基，或者所述待改造脯氨酸4-羟化酶的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:2的第90位的氨基酸残基从R替换为G，从而得到改造后的具有脯氨酸4-羟化酶功能的多肽；

或者

3)将所述待改造多肽的氨基酸序列中第112位的氨基酸残基，或者所述待改造脯氨酸4-羟化酶的氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:2的第112位的氨基酸残基从E替换为P或A，优选P，从而得到改造后的具有脯氨酸4-羟化酶功能的多肽；

或者