[发明专利]芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用

权利要求书

1.芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因sigmaF，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以pHT01质粒为模板，经PCR扩增获得Cm^r片段，所述Cm^r片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

(3)采用重叠PCR技术将步骤(1)获得的基因sigmaF与步骤(2)获得的Cm^r片段进行融合，制得融合基因sigmaF-Cm^r，所述融合基因sigmaF-Cm^r的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(4)将步骤(3)制得的融合基因sigmaF-Cm^r经酶切后，浓缩，转化克劳氏芽孢杆菌感受态细胞，经筛选得阳性重组菌，即可应用于产酶；所述浓缩后的融合基因sigmaF-Cm^r的浓度为300～500ng/μL；

所述产酶为产纤维素酶，纤维素酶的酶活为出发菌株的3～4倍。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下，下划线为BamH Ⅰ酶切位点：

sigmaF-F：CGCGGATCCATGAGTGCAGAGGTGAAAAACAGCGG，

sigmaF-R：GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAATGAGTGGTCGGCAAT；

PCR扩增体系如下，总体积50μL：

2×HiFi-PCR Master 25μL，上游引物sigmaF-F 2.5μL，下游引物sigmaF-R 2.5μL，克劳氏芽孢杆菌基因组DNA 2.5μL，ddH₂O 17.5μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min15s，共30个循环；72℃继续延伸10min。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下，下划线为BamHⅠ酶切位点：

Cm^r-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC，

Cm^r-R：CGCGGATCCTAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGG；

PCR扩增体系如下，总体积50μL：

2×HiFi-PCR Master 25μL，上游引物Cm^r-F 2.5μL，下游引物Cm^r-R 2.5μL，pHT01质粒2.5μL，ddH₂O 17.5μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min45s，共30个循环；72℃继续延伸10min。