[发明专利]芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用

说明书

本发明涉及芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用。本发明首次公开了芽孢形成相关基因sigmaF在产酶方面的作用，通过插入式失活的方式，将sigmaF部分基因片段与Cm^r基因融合，融合基因sigmaF‑Cm^r插入克劳氏芽孢杆菌sigmaF基因序列中，使sigmaF基因无法正常表达而失活，sigmaF基因失活菌株的芽孢形成率降低为出发菌株的0.6％，批次发酵纤维素酶发酵活力较出发菌株提高2.5倍左右。本发明构建的工程菌株提高了纤维素酶的发酵酶活，有利于芽孢杆菌类酶制剂生产菌株的遗传育种及工业化生产。

技术领域

本发明涉及芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，属于分子生物学技术领域及酶工程领域。

背景技术

克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)是常用工业生产菌株，在发酵生产过程中能产生蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶等多种酶类。其中，纤维素酶(β-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是一类能够降解纤维素，使之生成纤维素二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，可以将纤维素物质水解成葡萄糖。纤维素酶在食品、饲料、纺织、造纸等行业有广泛应用，近年来，在生物质的综合利用、生物能源清洁生产等方面的作用更是备受关注。为了获得高酶活力，不同的分子生物学手段应用于基因工程菌的构建，以通过多样性育种手段进一步提高酶活力，降低酶的规模化生产成本和使用成本。

中国专利文献CN106191013A(申请号201610853941.9)公开了一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法，该发明通过构建同源重组质粒，并转化巨大芽孢杆菌ATCC14581，得到表达纤维素酶的巨大芽孢杆菌工程菌，通过调节外界的温度或酸度可以定向的控制该巨大芽孢杆菌纤维素外切酶或内切酶的表达。中国专利文献CN102766615A(申请号201210256710.1)公开了一种利用芽孢杆菌制备纤维素酶的方法，其包括步骤：以芽孢杆菌为生产菌株，经过斜面培养、振荡培养、发酵培养而得，其中发酵培养的培养基包括质量含量的淀粉0.5-2％、豆饼粉1-5％、豆饼粉水解液8-12％、麸皮0.3-0.8％、无机盐1-2％、消泡剂0-0.3％，该方法得到的是在pH中性及碱性条件下高活性的纤维素酶，在水洗酶应用方面明显优于酸性纤维素酶。但是芽孢形成相关基因与产纤维素酶的关系尚没有明确报道，有研究发现，芽孢形成相关基因不仅影响芽孢的形成，对于菌株的结构、生长、代谢产物生成等也有调节作用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，选择性敲除芽孢形成相关基因sigmaF，构建芽孢缺失菌，可有效提高菌株纤维素酶的酶活。

发明概述：

本发明选择性敲除芽孢形成相关基因sigmaF，将克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因sigmaF与Cm^r片段进行重叠连接，通过酶切、浓缩后转化克劳氏芽孢杆菌，使芽孢形成相关基因sigmaF失活，构建克劳氏芽孢杆菌芽孢缺失菌，细胞代谢发生变化，菌株纤维素酶酶活显著提高，其酶活为出发菌株的3.5倍左右。

发明详述：

本发明的技术方案如下：

芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述产酶为产纤维素酶，纤维素酶的酶活为出发菌株的3～4倍。

根据本发明优选的，所述芽孢形成相关基因sigmaF在产酶中的应用，步骤如下：

(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因sigmaF，所述基因sigmaF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；